Bioinformatyka – wykład 4

Analiza sekwencji białkowej

Biochemia In-silico

Serwery „online” pozwalają określić wiele właściwości sekwencji białkowych

- masa cząsteczkowa

- współczynnik ekstynkcji

- połówkowy „czas życia” białka

Możliwa jest symulacja trawienia białka proteazami i rozkładu innymi czynnikami

chemicznymi. Dostępne na: www.expasy.ch

Podstawowe właściwości białka

• ProtParam

wyznacza paramtery fizykochemiczna sekwencji białkowej: skład aminokwasowy

i atomowy, punkt izoelektryczny, współczynnik ekstynkcji, stabilność, itp.

UWAGA podczas interpretacji wyników!

Przykład: właściwości synataksyny 1A szczura P32851

• PeptideCutter

przewiduje potencjalne miejsca trawienia sekwencji białkowej proteazami i czynnikami chemicznymi Przykład: trawienie albuminy surowicy człowieka

(ALBU_HUMAN, P02768)

Analiza lokalnych właściwości

• Wiele właściwości lokalnych istotnie wpływa na funkcję białka

- Regiony hydrofobowe mogą być domenami transmembranowymi

- Regiony „coiled-coiled” – wzajemne „nawinięcie” dwóch lub trzech alfa

α–helis są potencjalnymi domenami iterakcji białko-białko

- Jednolite regiony hydrofilowe są potencjalnymi pętlami „zahaczonymi” na powierzchni białka

• Techniki ich wykrywania

- Przewidywanie metodą „przesuwanego okna” (prosta)

- Przewidywanie metodami Ukrytych Modeli Markowa (wyrafinowana)

Technika „przesuwanego okna”

• Dobrze nadaje się do wykrywania silnych „sygnałów”. Metoda bardzo prosta

- niewiele artefaktów

- niezbyt wielka czułość

• Wykorzystanie: ProtScale na www.expasy.org

Praktyczna zasada:

- okno powinno mieć rozmiar

- zbliżony do rozmiaru

- wykrywanego efektu

Domeny transmembranowe:

• Wykrycie domen transmembranowych niesie wiele informacji o białku

• Wiele ważnych receptorów posiada w swej strukturze siedem (7) domen transmembranowych

• Segmenty transmembranowe można wykrywać z użyciem ProtScale (via

www.expasy.org)

• Najbardziej dokładne przewidywanie można uzyskać z wykorzystaniem

serwera TMHMM (Transmembrane Helices, Hiden Markov Models)

ProtScale – przykład :Fragment reduktazy żelazowej P78588

(FREL_CANAL)

Skala hyfrofobowości

- np. Kyte’a & Doolittle’a

- np. Eisenberg’a

ProtScale

- wybór szerokości okna ! (19)

TMHMM – przewidywanie domen transmembranowych

• TMHMM jest obecnie najlepszą metodą przewidywania obecności w strukturze domen transmembranowych

• TMHMM wykorzystuje metodę tzw. „ukrytych modeli Markowa”

• Zasada jest całkowicie różna od „przesuwanego okna” stosowanego przez ProtScale

• TMHMM daje tylko przewidywanie (ale bardzo prawdopodobne)

Model struktury przestrzennej rodopsyny:

Rodopsyna, ze względu na barwę nazywana też purpurą wzrokową lub czerwienią wzrokową – światłoczuły barwnik występujący w narządzie wzroku (pręciki w siatkówce) głowonogów, stawonogów i kręgowców. Rodopsyna warunkuje widzenie zmrokowe – tj. odcieni szarości. Rodopsyna składa się z białka opsyny, które wiązaniem kowalencyjnym łączy się z kofaktorem 11-cis retinalem (retinenem), który pełni rolę chromoforu. Wiązanie łączy ε- aminową grupę lizyny w pozycji 296 łańcucha białkowego z grupą aldehydową retinalu. Żaden inny stereoizomer retinalu nie wykazuje takiej właściwości łączenia się z opsyną. Pod wpływem światła docierającego do znajdującej się w pręcikach rodopsyny (wystarczy 1 foton) dochodzi do izomeryzacji formy 11-cis retinalu w drugi izomer – formę alltrans. Rodopsyna jest białkiem transbłonowym złożonym z 7 helikalnych łańcuchów i zmiana konformacyjna rodopsyny, powoduje aktywację związanego z nią białka G,

transducyny, a następnie inicjację sygnału komórkowego. Metarodopsyna II pod wpływem witaminy A powraca do formy 11-cis, łączy się z powrotem z opsyną w cząsteczkę rodopsyny gotową do rozpadu. Nazywa się to cyklem widzenia. Istotny wydaje się być sposób pobudzenia neuronów w siatkówce. W awitaminozie A synteza rodopsyny jest niemożliwa, co objawia się upośledzeniem widzenia o zmroku (tzw. ślepota zmierzchowa). Za odkrywcę rodopsyny uważa się Franza Christiana Bolla

Białka G i receptory sprzężone z białkami G

Przewidywanie regionów wtórnie zwiniętych helis („coiled-coil”)

• Obszary potencjalnego oddziaływania białko - białko

• Przewidywanie: COILS Serve (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)

• Przykład: dimer miozyny łańcuch lekki (aa. 953–1080)

Przewidywanie modyfikacji post-translacyjnych:

• Modyfikacje post-translacyjne bardzo często występują w różnych białkach bardzo w podobnych konserwatywnych wzorcach (motywach, szablonach) sekwencji

• PROSITE – baza danych większości znanych wzorców (motywów), każdy skojarzony z funkcją białka lub modyfikacją post-translacyjną

• PROSITE dostarcza bardzo obszernej dokumentacji każdej znanej funkcji wzorca (motywu)

• Możliwa jest wyszukiwanie wszystkich znanych wzorców PROSITE w dowolnej sekwencji białkowej np. w celu określenia bardzo prawdopodobnych modyfikacji potranslacyjnych np. w celu określenia prawdopodobnej lokalizacji wewnątrzkomórkowej np. w celu określenia prawdopodobnej funkcji białka

Dojrzewanie białka modyfikacje potranslacyjne:

Dojrzewanie może obejmować:

• usuwanie fragmentów

• specyficzne cięcie (cleavage) białka

• modyfikacje chemiczne

• fosforylację

• przyłączenie lipidów lub cukrów (glikozylacja)

Wzorce PROSITE’a i wyrażenia regularne

• Wzorzec: <A-x-[ST](2)-x(0,1)-{V}

• Tekst: Sekwencja musi zaczynać się (N-koniec) alaniną ^A, następnie jest dowolny aminokwas x, następnie jest dwa razy seryna lub treonina [ST](2), następnie dowolny aminokwas lub nic x(0,1), następnie dowolny aminokwas z wyjątkiem waliny {V}

• Wyrażenie regularne (Regexp): ^A.[ST]{2}.?[^V]

Przykłady wzorców PROSITE

• Enzymy

- Miejsce aktywne dehydrogenazy L-mleczanowej [LIVMA]-G-[EQ]-H-G-[DN]-[ST]

- Aktywacja ubikwityny P-[LIVM]-C-T-[LIVM]-[KRH]-x-[FT]-P

• Sygnatury potranslacyjne

- Miejsce fosforylacji kinazy tyrozynowej [RK]-x(2)-[DE]-x(3)-Y or [RK]-x(3)-[DE]-x(2)-Y

- Splicing białka [DNEG]-x-[LIVFA]-[LIVMY]-[LVAST]-H-N-[STC]

• Sygnatury oddziaływania DNA-RNA

• Histon H4 G-A-K-R-H

- p53 M-C-N-S-S-C-[MV]-G-G-M-N-R-R

Wyszukiwanie wzorców PROSITE

• PROSITE na ExPASy www.expasy.org/tools/scanprosite

• Wzorce/motywy PROSITE są zapisywane w postaci wzorców

- „wzorce” – krótkie sekwencje związane z bardzo istotnymi właściwościami białka (lokalizacja komórkowa, wiązanie liganda, zmiana postranslacyjna, …)

- krótkie wzorce są mało informacyjne (przypadkowość)

- wzorce jedynie wskazują możliwość !

- aby wyciągnąć wnioski, należy zestawić wynik PROSITE’a z innymi informacjami

- dobrze sprawdzają się w identyfikowaniu krótkich motywów o określonej funkcji biologicznej

• Nie wszystko jest w PROSITE !

• Aktualnie PROSITE zawiera ok. 1300 wzorców

• Inne specjalistyczne narzędzia do przewidywania post-translacynych modyfikacji: ExPASy sekcja Post-translational modification prediction

Przykład: prekursor ludzkiego czynnika V krzepniecia krwi – P12259

• Modyfikacja post-translacyjna:

Rozszczepienie proteolityczne na dwa łańcuchy:

Coagulation factor V łańcuch ciężki (koniec N)

Coagulation factor V łańcuch lekki (koniec C)

bardzo liczne glikozylacje

• Wykonanie:

- UniProt P12259

- ScanProsite

- „długie” wzorce

- „krótkie” wzorce: glikozylacja PS00001 ASN_GLYCOSYLATION aa. 51-54, …

uwaga: mirystylacja PS00008 MYRISTYL aa. ?20-27?, … (powinna występować na N-końcu)

Interpretacja wzorców PROSITE’a

• Sprawdź funkcję wzorca: Czy jest zgodna z badanym białkiem?

- wzorce mogą sugerować nieistniejącą cechę białka: np.: wzorzec mirystylacji u prokariota - nieprawdopodobne; w białkach prokariota nie występuje mirystylacja!

(mirystylacja – przeniesienie reszty kwasu mirystynowego na N-końcową resztę glicyny)

• Krótkie wzorce są bardziej informacyjne, jeśli są zachowane w sekwencjach homologów

- w tej sytuacji należy przygotować dopasowanie wielu sekwencji (prezentacja)

Domeny białkowe:

Definicja:

- strukturalna domeny białkowej - Niezależna jednostka fałdowania białka globularnego. Fragment cząsteczki białka zachowujący swój kształt po oddzieleniu od reszty cząsteczki białka

- oparta na sekwencji aa- Konserwatywne fragmenty sekwencji obecne w różnych białkach

• Domeny składają się co najmniej z 50 aminokwasów (mogą osiągać do 500 aa)

• Domeny są na ogół mniej konserwatywne niż wzorce, ale zazwyczaj są dłuższe

• Domeny opisywane są tzw. profilami (oraz wzorcami)

• Domeny są jednostkami funkcyjnymi

• W przypadku białek, analiza domen stopniowo zastępuje analizę wzorców

• Białka zazwyczaj zbudowane są z domen

• Domena jest autonomiczną jednostką fałdowania cząsteczki białka

• Domeny mają co najmniej 50 - 200 aminokwasów, rzadko mniej (np. palec cynkow)

• Częste jest występowanie równoczesne:domeny regulatorowej, domeny wiążącej, domeny katalitycznej np. immunotoksyna DTGM

• Tytyna (konektyna) – domeny białkowe

Tytyna – największe nieoligomeryczne białko, 34 tys. aa, m.cz. 3.8 mln. Da ok. 280 domen

• Ewolucja białka przez przyrastanie domen

• Ok. 2/3 białek organizmów jednokomórkowych i ok. 80% wielokomórkowych to białka wielodomenowe powstałe w wyniku duplikacji genów

• Wielodomenowe białka powstały w wyniku presji ewolucji na nowe funkcje

• Różne białka różnicowały się od wspólnego przodka przez różne kombinacje i przyłączanie domen

• Wiele tych samych domen znajdujemy u Archea, Bacteria i Eukariota

• Białka nicieni zawierają ok. 3x więcej domen niż białka drożdży, białka człowieka zawierają ok. 2x więcej domen niż białka nicieni

• Ta sama domena występuje w różnych białkach

• Domena posiada specyficzną funkcję, ale funkcja białka zależy również od innych domen w nim występujących

• Struktura i funkcja białka zmienia się, ale domeny zmieniają się mało (konserwatyzm)

• Aktualnie zdefiniowanych jest ok. 9 tys. domen (Pfam)

• Nowe sekwencje białkowe w większości powstają w wyniku kombinacji już istniejących, a nie „wynajdowania” nowych

• Nature is a tinkerer and not an inventor (Natura jest majsterkowiczem a nie wynalazcą) Jacob. F. (1977) „Evolution and tinkering” Science 196 (4295): 1161-6

Wykrywanie domen

• Wykrywanie domen przez: - porównywanie białek o podobnej funkcji,

- dopasowywanie sekwencji tych białek,- identyfikowanie konserwatywnych segmentów

• Domena jest dopasowaniem wielu sekwencji opisanym jako tzw. profil (w PROSITE; to nie jest wzorzec!)

• W każdej kolumnie wskazany jest aminokwas najczęściej występujący

• Profil opisuje częstość/prawdopodobieństwo występowania aminokwasu w danej pozycji

Palec cynkowy – domena białkowa:

• domena wiążąca DNA,bardzo „popularna” domena!

• krótka!: 25-30 AA - 2 krótkie odcinki β- sheets, następnie 〈-helix

• Zn2+ (kluczowy dla stabilności)

• 42 tys. białek w UniProtKB z tą domeną

Kolekcje domen

• Badacze wykrywają i charakteryzują domeny białkowe od ponad 20 lat – identyfikacja domen jest bardzo ważna – określa prawdopodobną funkcję białka

• Istnieje osiem (8) aktualizowanych kolekcji wykrytych domen

- Kolekcje ręczne są bardzo dokładne ale niewielkie

- Kolekcje automatyczne są bardzo obszerne ale mniej informacyjne

Kolekcje te : nakładają się na siebie i zostały zestawione przez różnych badaczy. Mają inne słabe i mocne strony, dlatego analizując swoje białko, należy korzystać ze wszystkich!

„Wielka 8”(prezentacja)

• Pfam jest największą kolekcją ręczną (ok. 8 tys.domen)

• Pfam występuje często jako odniesienie

Przeszukiwanie kolekcji domen:

• Domeny w Pfam na ogół posiadają znaną funkcję. Dopasowanie pomiędzy badaną sekwencją a domeną : wskazuje na możliwą funkcję białka, jest bardzo informacyjne dla dalszych badań!

• Trzy dostępne serwery do znajdowania domen przez przeszukiwanie kolekcji domen:

- InterProScan www.ebi.ac.uk/interproscan

- CD-Search (Conserved Domains) www.ncbi.nih.nlm.gov

- Motif Scan www.ch.embnet.org

Przykład: domeny białka fosB – FOSB_HUMAN P53539

• fosB, G0/G1 switch regulatory protein 3

• Wykonanie: UniProt P53539, InterProScan

„Suwak leucynowy”, „nożyce leucynowe” (ang. leucine zipper)

InterProScan to najpełniejsze wyszukiwanie domen w bazach domen. Daje możliwość porównania sekwencji z większością kolekcji. Nie podaje oceny statystycznej uzyskanych wyników.

Wynik przeszukiwania CD-Search:

• Serwer CD (Conserved Domain) udostępniany przez NCBI

• CD zawiera mniej baz niż InterProScan

• CD zawiera domeny (z NCBI) niedostępne w InterProScan (m.in. Cluster of Ortologous Group)

• Podaje statystyczną ocenę wyniku tzw. E-value

- 10e-15 Małe E-value Dobre dopasowanie

- 2.1 Duże E-value Złe dopasowanie

• Przykład: domeny białka fosB – FOSB_HUMAN P53539

• Wykonanie - UniProt P53539, CD server

Motif Scan

• Motif Scan zawiera domeny jeszcze niedostępne oficjalnie poprzez InterPro

• Oparty głównie o PROSITE’a i Pfam

• Najmocniejszy interfejs do PROSITE’a

• Podaje ocenę statystyczną wyniku (ang. score)

- Im wyższy wynik tym lepiej (mniej prawdopodobny przypadkowe podobieństwo do sekwencji domeny)

- Na ogół wyniki >7 mają wartość

- Wyniki „mocnego” dopasowania wyróżnione wykrzyknikiem (!)

• Unikatowy interfejs graficzny ze szczegółami dopasowania (ang. match detail)

Przeszukiwanie Motif Scan: Wykonanie: - UniProt P53539, - MotifScan

Analiza szczegółowa

Motif Scan daje możliwość sprawdzenia, czy aminokwas jest zachowany w badanej sekwencji

-Wysoki słupek powyżej 0 = Wysoce konserwatywny aminokwas w tym miejscu

-Zieleń = badana sekwencja ma oczekiwany aminokwas

-Czerwień = badana sekwencja nie ma w tym miejscu oczekiwanego aminokwasu

-R (Arginine) bardzo oczekiwana w tej pozycji • Wysoki słupek (np. potencjalne miejsce aktywne w przypadku enzymu)

-Jeśli badana sekwencja posiada w tym miejscu argininę . . .• Słupek wypełniony jest

zielenią (np. badane białko może posiadać aktywność enz.)

Kilka terminów

• Domeny są dzisiaj tak ważne, różne grupy badawcze nadają im różne nazwy: HMM, Domain,PSSM (Position Specific Score Matrix ),Profile (lub extended profile),MSA,

• Nazwy powyższe mają tylko nieco inne znaczenie, ale

• W większości przypadków można uznać, że oznaczają to samo (jeśli użyte są w kontekście dopasowania sekwencji)

Analiza domen in-silico

• Analiza domen (i wzorców) wydaje się być najbardziej informacyjną dot. białek techniką analityczną in-silico, jaka jest dzisiaj dostępna.

• Do badania własnych sekwencji dostępne są narzędzia on-line

Oprogramowanie do analizy sekwencji aminokwasowych

• ExPASy Expert Protein Analysis System

• Swiss EMBnet (http://www.ch.embnet.org/)

• CBS Prediction Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/)

• Biological Software w Institut Pasteur

• EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite (i wEMBOSS)

• GCG Wisconsin prod. Accelrys. Inc., pakiet już nie jest rozwijany, zastępuje go EMBOSS