Bioinformatyka – wykład 5

Wyszukiwanie w bazach sekwencji BLAST:

• Biologiczne znaczenie podobieństwa sekwencji

• Homologia, identyczność i podobieństwo

• Działanie BLAST’a

• Interpretacja raportu BLAST’a

• Biologiczne analizy z BLAST’em

• Działanie PSI-BLAST

Podobieństwo sekwencji

• Dwie sekwencje białkowe identyczne w ponad 25% (dla sekwencji ponad 100aa) są „prawie zawsze” homologiczne

• Dwie sekwencje DNA identyczne w ponad 70% (dla sekwencji ponad 100nt) są „prawie zawsze” homologiczne

• Sekwencje homologiczne posiadają : - wspólnego przodka (białka i DNA)

- podobną strukturę 3D (białka), - często podobną funkcję (białka)

Homologia

• Dwa białka o identyczności mniejszej niż 25%

- mogą być lub nie być homologiczne

- przy takiej identyczności nie można stwierdzić jednoznacznie

• Ten zakres podobieństwa określany jest jako tzw. „Strefa półmroku” (ang. „Twilight Zone”)

Homologia, podobieństwo i identyczność

• Identyczność jest miarą uzyskaną na podstawie dopasowania sekwencji

- sekwencja A może być „w 32 % identyczna” jak sekwencja B

• Podobieństwo jest miarą jak mało różnią się od siebie pod względem właściwości np. aminokwasy w pewnej pozycji dwóch sekwencji

- np. izoleucyna i leucyna są podobne

• Homologia jest cechą, która występuje lub nie występuje

- sekwencja A JEST lub NIE JEST homologiczna z sekwencją B

- sekwencja A NIE może być „w 40% homologiczna z” B

• Homologia jest ustalana na podstawie zmierzonej identyczności lub podobieństwa.

Jak ustalić homologię?

• Porównanie sekwencji białka A z każdą sekwencją w bazie danych np. SwissProt

• Zidentyfikowanie białka B, które jest np. w 40% identyczne do badanego

- (specjaliści preferują ocenę na bazie E-value)

• Jeśli A i B są bardzo podobne, możemy wnioskować o ich bardzo prawdopodobnej homologii

- analogia do np. „Jaś i Małgosia są prawdopodobnie rodzeństwem ponieważ są bardzo podobni”

• Jeśli znana jest struktura lub funkcja białka B, wtedy białko A i białko B bardzo prawdopodobnie posiadają tę sama strukturę lub funkcję.

Biologia in-silico:

• Ustalenie homologiczności białka A i B umożliwia ekstrapolację wiedzy uzyskanej z jednego z nich na drugie

• Jest to rodzaj wirtualnego eksperymentu

• Jest to „biologia in-silico”!

BLAST:

• BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

• Podstawowe narzędzie wyszukiwania lokalnegodopasowania

• BLAST – narzędzie porównywania sekwencji ze wszystkimi innymi sekwencjami zawartymi w bazie danych

• BLAST może porównać: - sekwencje nukleotydowe, - sekwencje białkowe

• BLAST dokładniej porównuje sekwencje białkowe niż sekwencje nukleotydowe

• BLAST dokonuje dopasowania lokalnego: - dopasowuje to, co może być dopasowane, - ignoruje resztę

• BLAST jest bardzo szybki np. przeszukanie SwissProt zajmuje kilka minut

• BLAST posiada szereg funkcji przygotowanych do różnorodnych zadań

BLAST – funkcje:

Wybór właściwego BLAST’a białkowego

Zadanie BLAST

Informacje nt białka (np. funkcji) blastp (P Û P)

blastp porównuje analizowane białko

z białkami w bazie danych

Wykrycie nowych genów kodujących tblastn (P Û P ¬ N)

białko tblastn porównuje analizowane białko

z sekwencjami DNA po translacji w 6 możliwych ramkach odczytu

Uruchomienie blastp

• Popularne publiczne serwery: NCBI blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, EBI www.ebi.ac.uk/Tools/sss/, EMBNet ch.embnet.org/software/aBLAST.html, ExPASy expasy.org/tools/blast/, Instytut Pasteur’a bioweb2.pasteur.fr/dbsearch/intro-en.html

• Wybór przeszukiwanej bazy danych: NR – aby szukać dowolnej sekwencji, Swiss-Prot – aby przeszukać białka o znanych funkcjach, PDB – aby przeszukać białka o znanej strukturze 3D

• „Wytnij” i „Wklej” badaną sekwencję ew. podaj jej kod

• ew. zmień macierz zastąpień (ang. substitution matrix) i karę za przerwy (ang. gap penalties)

• Kliknij przycisk BLAST

Blastp – przykład

• P09405 nucleolin Mus musculus; nukleolina jest wielofunkcyjnym głównym białkiem jąderkowym rosnących komórek eukariotycznych

• EMBnet Advanced BLASTp; Baza przeszukiwana: SwissProt; BLAST filter On/Off; tzw. filtr regionów o małej złożoności (ang. low complexity filter) w dopasowaniu: XXXXXXX…Domyślnie włączony

• NCBI BLASTp; Baza przeszukiwana: SwissProt; Filter Low complexity regions. Domyślnie wyłączony

Raport BLAST’a

• Ilustracja graficzna - przegląd dopasowań

• Wykaz „trafień” - ocena (tzw. score) każdego dopasowania

• Dopasowania - szczegóły każdego dopasowania

Ilustracja graficzna (NCBI Blast):

• Oś pozioma Query (0-700) odpowiada analizowanej sekwencji aminokwasowej (zapytanie)

• Kolor koduje jakość dopasowania; czerwień: bardzo dobre; zieleń: akceptowalne; czerń: złe

• Cienkie linie łączą niezależne dopasowania w tej samej sekwencji

Wykaz trafień

• Indeks (np. Accession number) znalezionej sekwencji

-zależny i charakterystyczny dla konkretnej bazy sekwencji

• Opis pobrany z bazy sekwencji

• Ocena dopasowania Score (Bits)

- Uzyskana na podstawie macierzy zastąpień

- Duża wartość oceny = dobre dopasowanie

- wartości poniżej 50 wskazują na bardzo słabe dopasowanie

• Wartość E-Value

- Mała wartość E-value = dobre dopasowanie

• Odsyłacze do innych powiązanych genomowych baz danych

blastp – macierz zastąpień (substytucji)

• Podobieństwo aminokwasów

Ocena E-Value

• E-Value oznacza Expectation Value tj. wartość oczekiwana

• Wartość E-Value jest najczęściej wykorzystywaną miarą do oceny podobieństwa sekwencji

• Odpowiada na pytanie:

„Ile razy może przypadkowo pojawić się dopasowanie sekwencji co najmniej tak

dobre jak uzyskane (tj. o nie gorszej ocenie Bits score) w przeszukiwanej bazie?”

- ocena oparta jest na wartości podobieństwa sekwencji i liczbie rekordów w bazie

danych

• Jeśli dopasowanie posiada bardzo małą wartość E-Value, jest bardzo wysoce prawdopodobne, że uzyskany rezultat nie jest wynikiem przypadku

- najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem obserwowanego podobieństwa jest wspólne pochodzenie

- wnioskujemy o homologii analizowanych sekwencji

• Wartość E-Value zależy od liczby rekordów w bazie!

„Dobre” i „złe” wartości E-Value

• Mała wartość E-value oznacza „dobre dopasowanie”

1 = „złe” E-Value

1e-3 = 1x10-3 = „graniczne” E-value

1e-4 = 1x10-4 = „dobre” E-Value

1e-10 = 1x10-10 = „bardzo dobre” E-Value

• Wartości E-Value mniejsze niż 1x10-4 wskazują na możliwą homologię

• Wartości E-Value większe niż 1x10-4 wskazują na konieczność dodatkowej analizy, aby potwierdzić ewentualną homologię

Dlaczego używamy E-Value?

• Wartości E-value umożliwiają porównywanie dopasowań różnej długości

• Wartości E-value są używane przez większość programów porównujących sekwencje

- PSI-BLAST (BLAST ukierunkowany na relacje ewolucyjne)

- Analiza domen (p. MotifScan)

- FASTA (wyszukiwanie sekwencji podobnych)

• Wartości E-Value zawsze mają takie samo znaczenie

- możność porównywania wyników różnych programów

Dopasowania na przykładzie NCBI Blast.

• Wgląd w klastry identyczności i podobieństwa

-bywa więcej niż jeden w sekwencji

-Identities identyczne

-Positives identyczne i podobne(+)

-Gaps przerwy w dopasowaniu

• Aminokwasy zaznaczone na szaro małymi literami (NCBI Blast) lub XXXX (EMBNet BLAST) są tzw. regionami o małej złożoności (ang. low-complexity regions)

- np. bogate w Pro (P) lub Glu (E)

- regiony o małej złożoności nie są brane pod uwagę podczas dopasowywania

- unikanie fałszywych trafień

BLAST sekwencji DNA

• Rodzaj zastosowanego BLAST’a a rodzaj sekwencji DNA

- kodujące DNA blastx (N ® P Û P), tblastx (N ® P Û P ¬ N)

- nie kodujące DNA blastn (N Û N)

• BLAST sekwencji DNA jest mniej dokładny niż BLAST sekwencji białkowej

• W przypadku kodującej sekwencji DNA blastx i tblastx dokona automatycznej translacji we wszystkich 6 możliwych ramkach odczytu

• BLAST nukleotydowy też może filtrować regiony o niskiej złożoności (ang. low complexity regions)

Zapytanie a BLAST

Wybór właściwego BLAST’a nukleotydowego

Zadanie BLAST

Analiza niekodującego DNA blastn (N Û N)

blastn działa dobrze tylko w

przypadku bliskich sekwencji DNA

(ponad 70% identyczności)

Wykrycie nowych białek tblastx (N ® P Û P ¬ N)

Wykrycie białek kodowanych przez blastx (N ® P Û P)

analizowaną sekwencję DNA

Ocena jakości sekwencji DNA blastx (N ® P Û P)

badana sekwencja DNA jest kodująca

ale istnieje podejrzenie, że zawiera

błędy w sekwencji

Znaczenie BLAST

• Oryginalna publikacja wprowadzająca BLAST jest czwartą najczęściej cytowaną publikacją naukową: ponad 21,000 cytowań nt BLAST, ponad 18,000 cytowań nt PSI-BLAST

• BLAST zmienił współczesną biologię !!!

• Kolejne slajdy pokazują więcej zastosowań procedur BLAST’a; niekoniecznie są to najlepsze procedury, są efektywną metodą badań rozpoznawczych

Poszukiwanie genu z BLAST’em

Zadanie

Poszukiwanie genu

Wykorzystanie BLAST’a

• Pocięcie sekwencji genomowej na krótkie (2~5Kb) nakładające się sekwencje. Użycie blastx do przeszukania podobieństwa każdego fragmentu wobec bazy białkowej NR (ang. Non Redundant protein database). Działa lepiej na genach bez intronów.

• Bardziej skomplikowaną alternatywą jest sekwencjonowanie mRNA lub użycie programu do przewidywania genów

Analiza strukturalna z BLAST’em

Zadanie

Przewidywaniestruktury 3D białka

Wykorzystanie BLAST’a

• Użycie blastp do wyszukania sekwencji podobnych w bazie Protein Data Bank (baza struktur przestrzennych). W przypadku uzyskania dobrego trafienia (ponad 25% identyczności) na całej długości sekwencji białka można wnioskować, iż analizowane białko ma podobną strukturę 3D.

• Skomplikowaną alternatywą jest analiza struktury białka metodą rentgenowską lub NMR lub przeprowadzenie modelowania homologicznego.

Analiza in-silico z BLAST’em

Zadanie

Przewidywanie funkcji białka

Wykorzystanie BLAST’a

• Użycie blastp do wyszukania sekwencji podobnych w bazie SwissProt. W przypadku uzyskania dobrego trafienia(>> 25% identyczności) na całej długości sekwencji białka, problem można uznać za w znacznej mierze rozwiązany – analizowane białko ma tę samą funkcję jak znalezione w bazie SwissProt.

• Skomplikowaną alternatywą jest przeprowadzenie analizy domen lub wykonania eksperymentów „na mokro”

Zgromadzenie członków rodziny białkowej

Zadanie

Znajdowanie członkówrodziny białkowej

Wykorzystanie BLAST’a

• Użycie blastp (lub PSI-BLAST – mocniejsza odmiana BLAST do wyszukiwania pokrewnych białek) do wyszukania sekwencji podobnych w bazie NR (ang. Non Redundant protein database). Po znalezieniu wszystkich członków rodziny, można wykonać dopasowanie znalezionych sekwencji i stworzyć drzewo filogenetyczne.

• Skomplikowaną alternatywą jest wykorzystanie PCR do klonowania analizowanej sekwencji

PSI-BLAST

• PSI-BLAST to Position-Specific Iterated BLAST

- bardziej czuły niż BLAST: znajduje dopasowania, które BLAST nie znajdzie

- bardziej specyficzny niż BLAST: znajduje mniej fałszywych dopasowań

- wolniejszy niż BLAST

• PSI-BLAST odnajduje odległe homologi

- pozwala na zidentyfikowanie bardzo odległych członków rodziny białka

• PSI-BLAST wykorzystuje wyniki każdej iteracji, aby zwiększyć specyficzność wyszukiwania

Iteracje PSI-BLAST

• PSI-BLAST wykorzystujenajlepsze wyniki pierwszejiteracji do utworzenia profilu(PSSM tj. position-specific scoring matrix)

• PSI-BLAST używa ten profil do ponownego przeszukiwania bazy

• PSI-BLAST kontynuuje przeszukiwanie aż do chwili, kiedy nie znajduje już nowych dopasowani

PSI-BLAST – przykład

• Analiza relacji leghemoglobiny z hemogloginą

Leghemoglobina jest hemoproteiną wiążącą tlen znalezioną w brodawkach korzeniowych roślin motylkowych. Rośliny te pozostają w symbiozie z bakteriami posiadającymi zdolność wiązania azotu atmosferycznego (bakterie brodawkowe). Kompleks enzymatyczny – nitrogenaza odpowiedzialny za przekształcenie azotu cząsteczkowego do jonów amonowych może działać tylko w środowisku beztlenowym. Dlatego jej działanie w komórkach korzeni roślin jest możliwe po obniżeniu stężenia tlenu poprzez związanie go z leghemoglobiną. (źródło: Wikipedia)

-P69905 (HBA_HUMAN) Hemoglobina człowieka

-PSI-BLAST w NCBI

• blastp > PSI-BLAST

• Database: Protein Data Bank (pdb)

• Kolejne iteracje: Run PSI-Blast iteration …

• Znalezione po 2-giej iteracji: 1GDI_A Chain A, Crystal Structure Of Ferric Complexes Of The Yellow Lupin Leghemoglobin With Isoquinoline

Kilka wskazówek dot. używania PSI-BLAST’a

• Jeżeli białko jest wielodomenowe, wyszukuj zgodności z jedną domeną na raz

• PSI-BLAST jest wolniejszy niż zwykły BLAST z powodu iteracji

• Można podać PSI-BLAST’owi własny profil PSSM (Position Specific Substitution Matrix)- w tym celu użyj serwer w NCBI (sekcja Algorithm parameters)