Bioinformatyka- wykład 3

Analiza sekwencji nukleotydowej

1. Usuwanie z sekwencji DNA „zanieczyszczeń”

2. Mapy restrykcyjne

3. Projektowanie starterów PCR

4. Znajdowanie w sekwencji DNA genów kodujących białka

5. Składanie całego genomu

Czyszczenie klonowanej sekwencji DNA:

• W celu sekwencjonowania genomów, badane sekwencje DNA są często klonowane w wektorze genetycznym (plazmid, sztuczny chromosom YAC lub BAC oraz kosmid)

• Sekwencja nukleotydowa wektora może zostać wymieszana z badaną sekwencją DNA

• Analizowana sekwencja DNA, powinna zawsze zostać najpierw „oczyszczona” np. przy pomocy NCBI VecScreen (również przed umieszczeniem sekwencji w publicznej bazie sekwencji)

• Przykład: czyszczenie sekwencji GenBank MVU87251

MVU87251 Neovison vison (norka amerykańska) GT dinucleotide repeat,

chromosome 7q2.1

VecScreen

Wektor klonujący plazmid pBR322 Escherichia coli

Obliczanie mapy restrykcyjnej

• Cięcie sekwencji DNA z użyciem enzymów restrykcyjnych

• Każdy typ enzymu restrykcyjnego rozpoznaje i rozcina inną sekwencję (na ogół palindromową):

EcoRI: 5’ G|AATTC 3’

3’ CTTAA|G 5’ (lepkie końce, Escherichia coli )

BamHI: 5’ G|GATCC 3’

3’ CCTAG|G 5’ (lepkie końce, Bacillus amyloliquefaciens )

AluI: 5’ AG|CT 3’

3’ TC|GA 3’ (tępe końce, Arthrobacter luteus )

• Znanych jest ponad 900 różnych enzymów restrykcyjnych, każdy o innej specyficzności

• REBASE The Restriction Enzyme Database

• Mapa restrykcyjna to lista wszystkich potencjalnych miejsc trawienia w cząsteczce DNA

• Programy obliczające mapę restrykcyjną: Webcutter, WatCut, TACG ,Restriction Mapping, Restriction Enzyme Picker, NEBcutter, SMS Restriction Map, RestrictionMapper, EMBOSS Nucleic restriction:remap, restrict, restover

• Przykład: mapa restrykcyjna wektora klonującego pBR322 pBR322, Webcutter

Projektowanie starterów PCR:

• Reakcja łańcuchowa polimerazy PCR – metoda powielania (amplifikacji) sekwencji DNA (K. Mullis, nagroda Nobla w 1993 r.)

• PCR wiele zastosowań

klonowanie genów

ustalenie ojcostwa

kryminalistyka

• cykliczne trzy etapy PCR (sterowane temperaturą):

denaturacja DNA (ok. 950),

hybrydyzacja starterów z matrycą (45 – 600, specyficzne dla startera),

polimeryzacja (elongacja) z użyciem termostabilnej polimerazy DNA (ok. 720),

• PCR powiela DNA pomiędzy dwiema kotwicami

• Po n cyklach (na ogół 20-40) jedna cząsteczka ulega ok. 2n amplifikacji

• Wystarczy znajomość tylko sekwencji oskrzydlających docelowy rejon DNA

• Kotwice to tzw. PCR startery (primery)

• Startery PCR

Typowa długość 20 (18 – 30) nukleotydów

Powinny „pasować” do końców analizowanej sekwencji

Powinny dobrze hybrydyzować z DNA w dobrze dobranej indywidualnej temperaturze hybrydyzacji

Projekt dobrego startera – b. ważny krok analizy

• Primer3Plus w BioTools@UMass Medical School bardzo dobre miejsce do łatwego projektowania starterów PCR. Znajduje:

dobrą lokalizację dla starterów

dobrą stabilizację

różne powielane długości

• Przykład: startery genu somatostatyny I człowieka

HUMSOMI w GenBank : somatostatyna J00306 Primer3Plus

EMBOSS Nucleic Primers:

eprimer3

primersearch

stssearch

Analiza składu DNA – zawartość G+C:

• Duża zmienność składu DNA

• Stabilność sekwencji DNA uzależniona od zawartość G+C (całkowita guanina i cytozyna)

• Duża zawartość G+C bardzo mocno stabilizuje cząsteczki DNA

• Określenie zawartości G+C w badanej sekwencji DNA np. EMBOSS: geecee

Przewidywanie genów:

• Najważniejszą analizą sekwencji DNA jest przewidywanie genów

• Przewidywanie genów wymaga różnych metod dla Prokariota i Eukariota

U Prokariota

• Brak intronów – geny kodujące białko są ciągłe

• Przewidywanie genów kodujących białko u Prokariota można uznać za problem rozwiązany osiągana dokładność – 99%

U Eukariota

• Introny – długie sekwencje niekodujące

• Eksony – krótkie sekwencje kodujące

• Przewidywanie genów Eukariota jest ciągle problemem otwartym

Większość metod wykorzystuje Model Ukrytych Łańcuchów Markowa (HMM)

Przewidywanie genów prokariotycznego genomu:

• U Prokariota geny kodujące białko są ciągłe - Brak intronów

• Przewidywanie genów kodujących białko u Prokariota można uznać za problem rozwiązany - osiągana dokładność – 99%

GeneMark – znajdowanie genów:

Prokariota

GeneMark bardzo dobry algorytm (program) dla genomów prokariotycznych

GeneMark potrafi:

znaleźć krótkie białka

analizować nakładające się geny

zidentyfikować najlepszy kodon startowy (ATG)

GeneMark wykorzystuje tzw. Ukryte Modele Markowa

GeneMark – przykład

Analiza genów genomu Rickettsia conori

GeneMark

Kompletny genom Rickettsia conori

GeneBank AE006914

Wynik

1 + <1 822 822 1

2 + 1039 1356 318 1

3 + 1367 2116 750 1

4 + 2117 2893 777 1

5 + 2890 5991 3102 1

…

1479 - 1266323 1267363 1041 1

1480 - 1267320 1268360 1041 1

Znaleziono 1480 genów, w tym zachodzące na siebie w innej ramce odczytu!

Przewidywanie genów Eukariota:

• Geny eukariotyczne są trudne do przewidywania

- sekwencje kodujące – eksony

- sekwencje niekodujące – introny

• Dokładne przewidywanie genów Eukariota jest ciągle problemem otwartym

- ENSEMBL zawiera ok. 22 tys. genów genomu człowieka. Jest prawdopodobne, że jest to większość genów człowieka (nadal jest nieznana dokładna ich liczba, pdp. ok. 22,5 tys., a nie jak niegdyś podejrzewano, iż jest to 30 – 70 tys. genów)

• Aktualne metody automatyczne dają 70% dokładnośćw przypadku genomu człowieka

• Przewidywanie genów Eukariota ciągle wymaga wspomagania danymi eksperymentalnymi (np. sekwencjami homologicznych białek)

• Algorytmy i programy znajdowania genów Eukariota nie wymagające do identyfikacji dodatkowych danych eksperymentalnych

- HMMgene

- GeneMark

- Geneid

- GENSCAN (nie mylić z GenomeScan)

- AUGUSTUS

- Na ogół mają trudności z poprawną lokalizacją eksonu inicjującego

• Algorytmy i programy znajdowania genów Eukariota wymagające do identyfikacji dodatkowych danych eksperymentalnych

- GenomeScan (nie mylić z GENSCAN)

- Wise2

- Dają dużo lepsze wyniki za cenę wspomagania znanymi sekwencjami białek homologicznych

Elementy powtarzalne a lokalizacja genów eukariotycznych:

• Elementy powtarzalne (ang. repetitive elements) w sekwencji DNA

- w większości przypadków nie kodują białek

- miewają strukturę podobną do regularnych sekwencji kodujących genów

- mogą prowadzić do przewidywania nieistniejących eksonów

- w niektórych genach są jednak sekwencjami kodującymi

- ich rola jest istotna, choć nie do końca poznana

• Maskowanie elementów powtarzalnych

- RepeatMasker Web Server

- Censor udostępniany przez bazę Repbase

• Przewidywanie genów dla

- sekwencji maskowanej

- sekwencji niemaskowanej

• Wybór „właściwej” sekwencji genu np. w oparciu o analizę podobieństwa (BLAST)

Maskowanie elementów powtarzalnych - przykład

AABR03001285.1 (AABR03001285.1.fasta) Rattus norvegicus strain BN/SsNHsdMCW chromosome 1, 4 clones RNOR03204165, whole genome shotgun sequence np. RepeatMasker GENESCAN

Wynik

Sekwencja niemaskowana gen1: 15 eksonów, białko 589aa

Sekwencja maskowana gen1: 14 eksonów, białko 544aa

Analiza BLAST(x,p) wskazuje na poprawność (pdp) wyniku przewidywania genu dla sekwencji maskowanej (tj. krótsze białko)

GenomeScan – znajdowanie genów eukariotycznych:

• GenomeScan bardzo dobry program (algorytm) do przewidywania genów

Eukariota

• GenomeScan wykorzystuje

- Ukryte Modele Markowa (HMM)

- poszukiwanie homologiczne, tj. wykorzystuje informacje eksperymentalne o podobnych białkach (przez BLASTx)

• GenomeScan działa dobrze z

- długimi eksonami

- genami o niskiej zawartości G i C

• Przykład – dane testowe Homo sapiens Xq28 genomic DNA; Białka homologiczne

• Inny „dobry” algorytm - Wise2

Tworzenie danych genomowych:

• Do niedawna sekwencjonowanie całych genomów było bardzo kosztowne i trudne

• Robiły to tylko nieliczne instytuty badawcze

• Dzisiaj szacuje się, że w ciągu kilku najbliższych lat koszty sekwencjonowania genomu człowieka spadną do ok. 1000$

- przy tej cenie możliwe stanie się złożenie własnego genomu

- zjawiska uboczne np.

pozytywne – zdrowszy tryb życia, profilaktyka, ukierunkowana zindywidualizowana terapia

negatywne – koszty ubezpieczenia zdrowotnego?

Jak złożyć cały genom z fragmentów sekwencji?

Sekwencjonowanie i składanie genomu:

Sekwencjonowanie całego genomu

• etap 1 – „pocięcie” na wiele małych nakładających się fragmentów o długości 150 – 200 kb

• etap 2 – klonowanie każdego fragmentu (z użyciem wektora)

• etap 3 – sekwencjonowanie każdego fragmentu metodą „shotgun” (F. Sanger, 1980)

- urządzenie sekwencjonujące analizują jedynie losowe krótkie fragmenty o długości ok. 1 kb zwane odczytami (ang. reads)

• etap 4 – konieczne składanie odczytów (reads) w tzw. kontigi (contigs) w oparciu o pokrywające się fragmenty

PHRAP – najbardziej popularny publicznie dostępny (dla nauki bezpłatny) program do składania fragmentów „shotgun” (pracuje również z bardzo długimi sekwencjami)

- www.phrap.org wymaga instalacji lokalnej („na komputerze”)

- CAP3 – inny popularny publicznie dostępny program do łączenia niewielkich danych, udostępniany m.in. przez Uniwersytet w Lyonie

http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php dostępny via WWW (maks. długość sekwencji nt wynosi ok. 50 tys. zasad)

Nieomówione ważne zagadnienia:

Biologicznie ważne sygnały zawarte w niekodujących fragmentach DNA

- Przewidywanie regionów promotorowych

- Elementy regulatorowe

- Miejsca wiążące białko