Genetyka molekularna 06.06.2013

Podstawy biotechnologii – GMO drobnoustroje

Biotechnologia- interdyscyplinarna dziedzina nauki i techniki zajmujaca się zmiana metrii ożywionej i nieożywionej poprzesz wykorzystanie organizmow zywych, ich części, bądź pochodzących od nich produktów, a także modeli procesow biologicznych

Biotechnologia: biała (przemyslowa), zielona(rolnicza), czerwona (medyczna)

Modyfikacja genomu: modyfikacja genomu dowolnego organizmu może być przeprowadzona przez człowieka na drodze:

- wprowadzenia nowej informacji genetycznej

- trwałej inaktywacji wybranego fragmentu genomu

- zmiany informacji genbetycznej w wyniku wywolania mutacji (np. zastosowanie mutagenezy fizycznej lub chemicznej)

Modyfikacja genomu prokariotów:

-wnikniecie DNA ze środowiska do wnętrza komórki i wlaczenie się , zazwyczaj na drodze rekombinacji, do genomu bakteryjnego (transformacja),

-wprowadzenie zrekombionowanego plazmidu,

-infekcja komórki bakteryjnej przy pomocy zrekombinowanego wirusa

Dlaczego prpodukuje się bakterie zmodyfikowane genetycznie?

- do tworzenia leczniczych peptydów: hormon wzrostu, insulina, szczepionka przeciw zapaleniu wątroby

- bakterie biodegraduyjące szkodliwe substancje

- wykorzystanie w produkcji określonych zwiazkow chemicznych

- bakterie stosowane w ochronie roślin : ochrona roślin przed przemarzaniem, ochrona korzeni przed owadami

- produkcja rekombinowanych enzymów stosowanych w genetyce molekularnej

Zaletyy produkcji rekombinowanych bialek przez bakterie?:

- wytwarzają duże ilości bialek (nawet >50% wszystkich bialek w komórce), które sa trudne do uszykania w naturze

- latwosc pozyskania

- brak ryzyka infekcji pochodzenia zwierzęcego lub ludzkiego

- latwa hodowla, nizsze koszty pożywek niż w hodowli komorek ssaczych czy owadzich

- latwiejsza kontrola hodowli niż w przypadku roślin

- prosty system selekcji (antybiotyki)

Wady:

- trudności w uzysakaniu dużych bialkek o licznych mostkach dwusiarczkowych i wymagających obróbki potranslacyjnej

- skonnosc do tworzenia ciał inkluzyjnych( bialko ulegajace np. krystalizacji)

- nieprawidłowe fałdowanie białek

Do nadekspresji rekombinowanych bialek przez e coli używa się promotora zależnego od polimerazy RNA faga T7

Gen polimerazy RNA faga T7 znajduje się pod kontrolą promotora lac, co umozliwia jego indukcję przy pomocy IPTG

Polimeraza T7 prowadzi bardzo wydajną transkrypcję z szybkością 230 nt/sek – prawie 5 razy szybciej niż polimeraza RNA e coli ( prawie 5 razy szybciej powstają białka)

Hodowla drobnoustrojow w celu uzyskania rekombinowanych bialek na skalę przemysłową – w BIOREAKTORACH

Hodowla w bioreaktorze pozwala kontrolować : stężenie ważnych gazów, pH, temperaturę, stężenie substancji odżywczych, stężenie metabolitów, tempo wzrostu i gęstość hodowli (ilość komórek)

Wydzielanie rekombinowanych białek:

- w postaci ciał inkluzyjnych : dotyczy glownie bialek, które powstają zbyt szybko i w zbyt dużej ilości i sa toksyczne dla komroki. Z reguły bialka w tej formie sa nieaktywne

- w postaci rozpuszczalnej (najbardziej pożądane); w cytosolu lub wydzielanie do przestrzeni periplazmatycznej

Szybkie i wydajne oczyszczanie rekombinowanego bialka osiąga się poprzez polaczenie ramki odczytu rekombinowanego bialka z sekwencjami kodującymi krótkie peptydy ( np. heksapeptyd His (6)[reszty histydyny, jedna za drugą]) lub domeny pozwalające na oczyszczenie np. metodą jednostopniowej chromatografii powinowactwa na złożu, zawierające Ni lub Co

Leki rekombinowane – początki wproweadzania na rynek farmaceutyczny : 1982 rekombinowana ludzka insulina, 1985 rekombinowany hormon wzrostu, 1986 rekombinowane cytokiny: interferon alfa-2a i interferon alfa-2b, oraz rekombinowana szczepionka przeciw wirusowemu zapaleniu wątoby typu B

Proinsulina i insulina – insulina u człowieka jest najpierw pridukowana w formie proinsuliny, po uwolnieniu peptydu C staje się insuliną

Do produkcji biofarmaceutyków wykorzystuje się przede wszystkim modyfikowane:

- bakterie ( e coli)

- drozdze piekarnicze ( s. cereviseae)

- zwierzęce linie komórkowej ( CHO- jajnik chomika chinskiego, BHK- nerka małego chomika)

- ludzkie linie komórkowe

Rekombinowane bialka produkowane przez drobnoustroje: kalcytonina, gonadotropina kosmowkowa, erytropoetyna, czynniki VII, insulina, interferony, interleukiny, tkankowy aktywator plazminogenu, hormon wzrostu

Leki rekombinowane :

- pierwszej generacji ( bialka o strukturze identycznej z białkami ludzkimni)

- drugiej generacji ( bialka o nieco zmodyfikowanej strukturze)

Biofarmaceutyki drugiej generacji :

Cel : poprawienie farmakokinetyki i biodystrybucji leku, ograniczenie dzialan niepożądanych, poprawienie ukierunkowania i skuteczności terapii

Modyfikacja polega na ; zmianie sekwencji aminokwasow, modyfikacji chemicznej bialka np. glikozylacja, polaczenia dwóch lub większej liczby peptydów

Insulina drugiej generacji

Modyfikacja : zmiana sekwencji niektórych aminokwasów

Efekt: otzrymanie szybko i długodzialajacych analogów insuliny

Hematopoetyczny czynnik wzrostu drugiej generacji

Modyfikacja: kowalencyjne przyłączenie do bialka polietyloglikolu

Efekt: porzedluzont efekt poltrwania i podniesienie stabilności termicznej

Modyfikowane genetycznie drobnoustroje w przemysle spożywczym : aspergillus Niger, aspergillus oryzae, fusarium venetatiumm pseudomonas, trichoderma, - przewaga grzybow

Zrekombinowane bialka wykorzystywane w przemysle : renina, alfa- amylaza, bromelaina, katalaza, celulaza, proteaza, lipaza

Modyfikowane genetycznie bakterie w bioremediacji ; bioremediacja to metoda wykorzystujaca zywe organizmy i wytwarzane przez nie enzymy w procesach oczyszczania środowiska

Wykrywania GMO:

Identyfikacja GMO odbywa się poprzez wykrywanie:

- sekwencji typowych dla konstruktorów genowych np. promotora 35s wirusa CaMV i sekwencji terminatora genu syntetazy nopaliny ( tNOS)

- wporwadzanych genow nadających organizmom specyficzne cechy np. oporności na Roundup(herbicyd) lub szkodniki

Techniki molekularne stosowane do wykrywania GMO :

- PCR w czasie rzeczywistym: wartość temperatury topnienia npowstajacyh produktów PCR pozwala potwierdzić specyficzność reakcji: wartość Ct (lub Cp) pozwala na ocenę ilościową

- techniki mikromacierzowe ( one umozliwiaja analizę wiekszej ilości genow na raz)

- PCR multipleks z wyznakowanymi starterami i rozdzial elektroforetyczny w sekwenatorze kapilarnym