RAPD – stanowi wariant techniki PCR.
Różnice między RAPD i PCR:
-stosuje się pojedynczy starter o znanej lecz przypadkowej sekwencji nukleotydów
-produkt stanowi mieszanina wielu fragmentów
Etapy RAPD:
-izolacja DNA
-reakcja PCR z losowym starterem
-rozdział produktów reakcji na żelu
-wizualizacja prążków
-analiza wyników
DNA do RAPD:
-genomowe, mitochondrialne lub chloroplastowe
-nie może być zanieczyszczony obcym DNA
-powinno być dobrej jakości (niezdegradowane)
Zła jakość DNA = zafałszowanie wyników
Reakcja PCR:
*składniki PCR:
a)komponenty do PCR: DNA, nukleotydy, primery, termostabilna polimeraza DNA, bufor, woda
b)losowy starter
Reakcja PCR
Starter do RAPD
Stosuje się jeden, krótki starter (kilka do kilkunastu nt)
Sekwencja startera jest przypadkowa
Powyższe cechy starterów umożliwiają przyłączanie się w losowych miejscach
* możemy spodziewać się występowania wielu sekwencji
komplementarnych w genomie.
Reakcja PCR /Warunki
Etapy jak w klasycznym PCR
Obniżenie temperatury przyłączania starterów = obniżenie komplementarności wiązania startera do matrycy
Reakcja PCR Amplifikacja
Do amplifikacji dochodzi, gdy startery dołącza się
w komplementarnym miejscu genomu, a odległość
pomiędzy dwoma z nich nie przekroczy 1000 – 1500 pz
Uzyskuje się od kilku do kilkudziesięciu fragmentów
DNA o różnych długościach
Reakcja PCR Amplifikacja
Dochodzi do amplifikacji wielu przypadkowych fragmentów
Sekwencje produktów reakcji i ich miejsce występowania w genomie są nieznane
Wizualizacja prążków
Wizualizację wyników przeprowadza się poprzez elektroforezę w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym
Analiza wyników
Różnice we wzorze prążkowym między osobnikami
wynikają z:
Wystąpienia mutacji (insercji, delecji lub mutacji punktowej) w obrębie miejsc wiązania startera =brak prążka
Pojawienia się nowych miejsc wiązania startera w wyniku zajścia mutacji = wystąpienie nowego prążka
Delecja lub insercja pomiędzy miejscami wiązania startera = zmiana długości produktów
Zalety RAPD
Nie jest potrzebna znajomość sekwencji DNA analizowanego gatunku
Niska pracochłonność
Stosunkowo mały koszt
Krótki czas wykonania analizy
Wady RAPD
Amplifikacja przypadkowych fragmentów
Brak możliwości odróżnienia homozygot dominujących od heterozygot
Komigracja prążków
Mała powtarzalność wyników
Ryzyko zanieczyszczenia obcym DNA
Zastosowanie RAPD
Identyfikacja gatunków i szczepów oraz stopnia ich pokrewieństwa
Identyfikacja patogenów
Poszukiwanie markerów sprzężonych z ważnymi cechami fenotypowymi zwierząt i roślin