PCR (Polymerase Chain Reaction) - Łańcuchowa Reakcja Polimerazy

+Technika selektywnego, powtarzalnego cyklicznie namnażania (amplifikowania) dowolnego regionu genomu na matrycy DNA

+Pozwala na powielenia dowolnej sekwencji o długości od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów

+1983 roku przez Kary Mullis

+Jest odpowiednikiem replikacji DNA - przeprowadzanym in vitro

Składniki reakcji PCR:

+Matryca DNA

+Startery flankujące amplifikowany rejon

+Deoksyrybonukleotydy

+Polimeraza DNA

+Bufor z MgCl₂

Polimeraza działa od 5' do 3', wzrost wykładniczy 2ⁿ, niektóre moga się pochwalić że mają właściowści egzonukleazy 3' do 5'

Limitacje:

+ilość starterów

+ilość polimerazy

+ilość nukleotydów

+wysycenie reakcji.

Pierwszy etap:

Denaturacja>rozwija helisa na jednoniciowe DNA

Przyłączenie starterów do jednoniciowych DNA

Elongacja>działanie polimerazy

I znowu zapętlenie i tak n razy

Startery

Krótkie, syntetyczne oligonukleotydy, zaprojektowane tak, aby być komplementarne do określonego fragmentu matrycy DNA;

służące do zapoczątkowania reakcji PCR

5' ------------------------ --GGGTACCT 3' matryca

3' Club G!!(patrz niżej)-----ATGGA 5' starter

Pamiętać zawsze podpisac matryce i starter

Projektowanie starterów

Długość optymalna 18-24 nukleotydy

Prawdopodobieństwo przypadkowego odnalezienia w matrycy DNA określonego ciągu nukleotydów

4ⁿ n-liczba nukleotydów

N=1 ¼ na znalezienie A,G,C lub T

n=2 1/16 Dwunukleotydu

n=4 1/256 na 4-nukleotyd

Oba startery muszą mieć podobną temperature topnienia(przyp. Taka temperatura w której połowa dupleksów DNA ulega dysocjacji do pojedyńczych nici

Tm = 4°C x (G + C) + 2°C x (A+T)

Temperatura przyłączania starterów (Annealing temperature, Ta) - temperatura, przy której pojedynczoniciowe cząsteczki DNA ulegają asocjacji, tworząc strukturę dwuniciową

Ta = Tm - 5°C

Przy projektowaniu starterów ważne jest by:

+Stosunek puryny:pirymidyny - około 1:1 (możliwy 40-60%)

+ G lub C wśród ostatnich pięciu nukleotydów na końcu 3' pomaga w specyficznym wiązaniu do matrycy

+Unikać ciągu 3 lub więcej G lub C na końcu 3' - może powodować preferencyjne wiązanie w rejonach bogatych w pary GC

+ Unikać T na końcu 3' - T jest podatna na błędne wiązanie do matrycy

+Unikać sekwencji powtarzalnych i ciągów tego samego nukleotydu(maksymalnie 4 powtórzenia)

+Unikać sekwencji generujących drugorzędowe struktury, na skutek wewnętrznej komplementarnośc

+Unikać sekwencji tworzących dimery starterów

Koncentracja starterów:

- Oba startery powinny mieć taką samą koncentrację

- Zalecana ilość - 5 - 50 pmol każdego startera w 50 µ l reakcji

- 95% starterów pozostaje niewykorzystanych w 30 cyklach reakcji

Zbyt wysokie koncentracje prowadzą do powstawania artefaktów(większe prawdopodobieństwo tworzenia dimerów i błędnego parowania matrycy)

Polimeraza DNA

Enzym katalizujący polimeryzację deoksyrybonukleotydów wzdłuż odczytywanej matrycy DNA.

Nowo powstająca nić jest komplementarna do matrycy.

Polimeraza TAQ

Pochodzi z bakterii Temus aquaticus

Optimum temp 72-75 stopni

aktywność polimerazy 5'do3'

aktywność ehzonukleazy 5'do3'

brak aktyw. Egoznukleazy od 3'do5'

przy 95 stopniach czas aktywności to 40 min około 50 cykli PCR

efektywna amplifikacja ok. 2-4kpz

Polimeraza TAQ

-wierność amplifikacji

Brak aktywności egzonukleazy 3' - 5' może prowadzić do błędów w amplifikacji

Częstość błędów: ~1 błędnie wstawiona zasada na 104 nukleotydów~1 przypadek zmiany ramki odczytu na 4 x 104 nukleotydów

Bardzo niskie prawdopodobieństwo tych samych błędów w niezależnych reakcjach

-Procesywność

ilne interakcje - wysoka procesywność - większy odcinek DNA zostanie zamplifikowany zanim polimeraza oddysocjuje od matrycy

Im wyższa procesywność, tym niższa wymagana koncentracja polimerazy

Termocykler:

-dokładny

-utrzymuje stałe parametry podczas całej rekacji

-duża szybkość zmian 1-4 na sek

-podgrzewana pokrywa

-powtarzalność reakcji

Elektroforeza(przypomnienie)

Zjawisko przesuwania się cząsteczek np. DNA pod wpływem działania pola elektrycznego, w stosunku do nieruchomego ośrodka rozpraszającego (żelu)

Żel - trójwymiarowa sieć polimeru, stanowiąca sito molekularne, w którym następuje rozdział DNA pod względem długości cząsteczek

żel agarozowy

Wybarwianie bromkiem etydyny - substancją wiążącą się na stałe z cząsteczkami DNA (silna trucizna!!!) i świecącą w świetle UV

Od czego zalezy igracja DNA na żelu?

-długość cząsteczki

-skład nukleotydowy

-konformacja cząsteczki

-stężenie zelu

-przyłożonego napięcia

-siły buforu.

---