Molekularne techniki diagnostyczne.

W tej chwili powiem kilka słów o metodach które służą do wykrywania konkretnych mutacji, a najczęściej są to mutacje punktowe w przypadku techniki PCR-RFLP , a czasami są to techniki, które służą do badania wariantu allelu który posiadamy. Technika PCR-ASO jest stosowana na dzień dzisiejszy właściwie tylko do jednego celu mianowicie do identyfikacji haplotypów HLA, jest ona niezbędna przy genotypowaniu układu HLA, mimo że daje to pewne wyniki fałszywe ponieważ tam występuje dużo tzw. psuedogenów, nie mniej jednak ta technika jest wykorzystywana ze względu na szybkość, łatwość i dosyć wiarygodne wyniki. Natomiast skupmy się nieco bardziej na technice PCR-RFLP, państwo znacie już wcześniejszą odmianę tej techniki, która nazywała się po prostu RFLP i proszę tych technik nie mylić ponieważ one obie wykorzystują tzw. enzymy restrykcyjne nie mniej jednak zasada ich działania jest zupełnie inna. W technice RFLP mieliśmy do czynienia z tzw. southern/nothern blottem który służył do wykrywania polimorfizmów w naszym genomie i w ten sposób można było identyfikować osobniki. Technika PCR-RFLP służy do wykrywania mutacji punktowych i jest ona jedną z głównych technik obecnie stosowanych w diagnostyce molekularnej, wiele chorób uwarunkowanych genetycznie ale nie tylko, bo np. co ciekawe taka choroba jak hemochromatoza (mimo, że jest uwarunkowana genetycznie) ale wcześniej wykrywano ją zupełnie inaczej obecnie dzięki poznaniu struktury odpowiednich genów jesteśmy w stanie wykrywać ją bardzo łatwo technikami molekularnymi, jest to prostsze i tańsze ponieważ inne techniki klasyczne laboratoryjne dają wiele wyników błędnych, zarówno fałszywie dodatnich jak i fałszywie ujemnych. Zanim jednak przejdę do tej techniki powiem kilka słów na temat enzymów restrykcyjnych, nie tylko dlatego, że są one wykorzystywane w tej technice, ale także dlatego, że to pokazuje, że ewolucja tak naprawdę jest nudna – wykorzystuje do bólu ciągle te same motywy, jak już raz coś wymyśliła to później przez kolejne kilkaset milionów lat będzie to kontynuować co najwyżej lekko je modyfikując i pokaże państwu odpowiednik pewnych mechanizmów, które występują u organizmów prokariotycznych a które występują także u nas w naszym genomie. Nie mniej jednak endonukleazy restrykcyjne występują wyłącznie u prokariota (przynajmniej te o których będę dzisiaj mówił) ponieważ istnieją odpowiedniki tych enzymów w organizmie eukariotycznym ale to jest temat myślę zbyt szeroki i na razie nie powinien was interesować. Jakie są ich funkcje ? W bakteriach generalnie chronią one przed bakteriofagami, jak wspominałem państwu przy okazji doświadczeń udowadniających funkcję kwasów nukleinowych, że tam właśnie infekowane bakterie tzw bakteriofagami, które wstrzykują materiał genetyczny do wnętrza komórki bakteryjnej no i w efekcie ta komórka zaczyna syntetyzować białka takiego bakteriofaga no i żeby te enzymy restrykcyjne mogły te organizmy chronić przed bakteriofagami wykorzystały bardzo sprytny mechanizm. Mianowicie każda endonukleaza restrykcyjna rozpoznaje charakterystyczną dla siebie sekwencje nukleotydową i jeżeli ją rozpozna to zaczyna to DNA trawić w obrębie tej sekwencji z tą endonukleazą natomiast własne DNA bakteryjne jest wtedy chronione przed działaniem tej endonukleazy przez system metylacji. W związku z tym in vivo w komórce bakteryjnej zawsze odpowiednia restrykataza występuje w połączeniu z metylazą, która metyluje sekwencje nukleotydowe znajdujące się w obrębie tego fragmentu, który przez enzymy restrykcyjne są rozpoznawane. Dzięki temu własne komórka bakteryjna jest chroniona, natomiast jeśli do tej komórki wniknie obce dna to w tym momencie jest małą szansa ze ono jest metylowane w efekcie jest podatne na działąnie enzymów restrykcyjnych i ulega strawieniu i zniszczeniu. Obecnie tych enzymów – endonukleaz restrykcyjnych znamy kilka- może kilkanaście tysięcy, a w powszechnym użyciu jest co najmniej kilkaset z nich. I tak jak mówię one są takim podstawowym elementem w technikach molekularnych, zarówno narzędziem diagnostycznym w technice PCR-RFLP ale są też wykorzystywane w klonowaniu – ma to duże znaczenie w biotechnologii, w biosyntezie różnych białek o pożądanych funkcjach. Endonukleazy restrykcyjne wraz z metylazami wykorzystują mechanizm modyfikacji nukleotydu, który w efekcie prowadzi do tego, że dana sekwencja staje się odporna na działanie restryktazy. I generalnie jako zasadę od której praktycznie nie ma wyjątków można przyjąć, że jeżeli dana sekwencja zawiera metylowaną adeninę lub cytozynę gdyż tylko te dwa nukleotydy mogą tej modyfikacji ulegać w tym momencie enzym restrykcyjny nie jest w stanie tej sekwencji rozpoznać i co za tym idzie nie jest w stanie jej strawić. O tych metylacjach proszę pamiętać ponieważ istnieją odpowiedniki tego procesu u organizmów eukariotycznych, w tym u człowieka. Co prawda na dzień dzisiejszy wydaje się że u człowieka metylacji ulegają wyłącznie cytozyny, natomiast Adeniny ulegają metylacji wyłącznie wtedy gdy znajdują się w mRNA, natomiast nie wiadomo co przyniosą przyszłe odkrycia. U bakterii w tym procesie metylacji biorą udział 2 metylazy, jedna się nazywa DAM DCM, które odpowiednio modyfikują adeninę w pozycji N6 lub cytozynę w pozycji C5. Dodatkowo ta metylaza DCM jest zależna od takiej sekwencji czyli metyluje cytozynę wyłącznie w takim pentanukleotydzie, w efekcie jeśli mielibyśmy jakąś losową sekwencję nukleotydów to dla DAM taka sekwencja występuje co 250 nukelotydów a dla DCM co 512, to jest istotne z punktu widzenia biologii i o tym państwo pewnie będziecie się uczyć na mikrobiologii. Teraz jak to mniej więcej działa : czyli mamy genom bakteryjny który zawiera tzw. miejsca rozpoznawane przez restryktazę, żeby ten własny genom bakteryjny nie był trawiony ulega on modyfikacji przy udziale tych 2 wcześniej wymienionych metylaz, których koenzymem jest N-adenozylometionina o której będziemy mówić przy okazji koenzymów. W efekcie to własne bakteryjne DNA podlega metylacji i enzym restrykcyjny nie jest w stanie zniszcyć tego DNA – własne DNA jest chronione. Natomiast jeśli do takiej komórki bakteryjnej dostanie się bakteriofag to w tym momencie te nasze ‘’małe pac-many’’ strawią to DNA wirusowe ze względu na to że on nie ulega ochronnej metylacji. Oczywiście bakteriofagi też unikają tego mechanizmu poprzez to że czasami ich DNA jest metylowane, albo kodują one enzymy będące inhibitorami restrykaz. Dlaczego te endonukeazy restrykcyjne są takie ważne? Tak jak wspomniałem są także wykorzystywane jako podstawowe narzędzie w technikach molekularnych, każda restryktaza ma charakterystyczną dla siebie sekwencje rozpoznawaną, w związku z tym jeżeli tak się zdarzy, że w genomie człowieka występuje miejsce restrykcyjne i my na to nasze DNA działamy restryktazą to nasze DNA zostanie pocięte na kawałki. W genomie mogą zdarzyć się mutacje, mutację mogą polegać na tym że np. ta sekwencja rozpoznawana przez restryktazę ulegnie zmianie i w tym momencie to DNA które normalnie było cięte to zmutowane cięte nie będzie – następuje zniesienie miejsca restrykcyjnego, lub też może się zdarzyć tak, że mutacja wprowadzi nowe miejsce restrykcyjne czyli tam gdzie DNA nie było rozpoznawane przez określoną restryktazę nagle staje się rozpoznawane i w efekcie pojawia się nowe miejsce cięcia i my to możemy bardzo łatwo wykryć. Generalnie restryktazy bakteryjne należą do enzymów, które występują w 3 różnych klasach. Klasa I i III jest dość skomplikowana i wymaga różnych kofaktorów min. ATP, natomiast taką prostą klasą jest klasa II, której restryktazy do swego działania wymagają wyłącznie jonów 2wartościowych, przeważnie są to jony Mg, rzadziej jony Mn i innych pierwiastków. Rozpoznają one sekwencje 4-8 nukleotydów, czyli bardzo krótkie, co też powoduje że jeśli taką restryktazą byśmy zadziałali na cały genom to otrzymalibyśmy kilkaset tys do kilku mln fragmentów, jeżeli tak pocięty genom poddalibyśmy później elektroforezie to otrzymalibyśmy szeroki rozmazany pasek. W związku z tym one średnio się nadają do tego typu rzeczy, potrzebowalibyśmy jeszcze sondę nukleotydową która wybierałaby z tych prążków tylko kilka. Co ciekawe miejsce cięcia może być w obrębie sekwencji rozpoznawanej albo poza nią, jest jednak ono zazwyczaj stałe co ma dla nas bardzo duże znaczenie do identyfikacji. (tu gadanina o slajdzie, bez slajdu nic nie wnosi więc ominąłem) Jak wspomniałem restryktazy są homodimerami, których taką specyficzną cechą jest rozpoznawanie tzw sekwencji palindromowych (które czytane od przodu i od tyłu dają to samo). Identyczne podjednostki restryktazy rozpoznają tą samą sekwencję DNA, ten sam motyw musi być czytany raz normalnie a raz wspak (nici DNA są tutaj zakręcone o 180 stopni) dlatego wszystkie sekwencje rozpoznawane przez restryktazy są sekwencjami palindromowymi. Miejsce cięcia może być symetryczne lub asymetryczne. Tutaj mamy wzorcowy genom faga lambda, który jest cięty przy pomocy odpowiedniej restryktazy, później przy rozdziale na żelu daje nam układ charakterystycznych prążków, każdy prążek odpowiada jednej długości pociętych fragmentów i możemy go zidentyfikować. Jeżeli weźmiemy inną restryktazę to ona rozpozna inne miejsce cięcia i w efekcie zobaczymy inny wzór restrykcyjny na żelu. W efekcie cięcia symetrycznego powstają tępe końce, które zasadniczo mało ważne, one są bardzo fajne w technice PCR-RFLP gdyż nie mają tendencji do sklejania się więc bardzo łatwo to rozdzielić na żelu. Ale druga możliwość to cięcie asymetryczne, powstają lepkie końce, każda nić kończy się oligonukleotydem który zawiera określoną sekwencję, tego typu oligonukleotyd będzie się zachowywał jak sonda molekularna , tzn będzie miał zdolność do rozpoznawania sekwencji komplementarnej. Jeżeli je rozpozna, a sekwencje komplementarne będą w tej drugiej nici to wtedy te nici się z powrotem połączą, przy czym tu nie zadziała ligaza toteż to połączenie będzie bardzo słabe – wiązanie wodorowe między kilkoma nukleotydami. Ono się będzie bardzo łatwo rozpadać np. po podgrzaniu roztworu. Takie końce utrudniają w technice PCR-RFLP interpretację wyników, ponieważ DNA po cięciu może ponownie ulec hybrydyzacji i będzie nam dawało na żelu obraz taki jakby tego cięcia w ogóle nie było, dlatego najczęściej trzeba wprowadzić jakiś czynnik denaturujący najczęściej temperatura który utrudni tworzenie takich hybryd. Lepkie końce możemy wykorzystać w technice która nie ma znaczenia diagnostycznego ale ma olbrzymie znaczenie w biologii molekularnej i biotechnologii – technika klonowania. Najczęściej dobiera się plazmid który dla danego enzymu restrykcyjnego ma tylko 1 miejsce cięcia, jeżeli to potniemy to wtedy ta kolista cząsteczka DNA stanie się strukturą liniową zawierającą lepkie końce. Do tego plazmidu chcemy wklonować gen, który nas interesuje i będzie ulegał ekspresji w komórce bakterii, aby połączyć dany gen musi mieć on lepkie końce o sekwencji komplementarnej do utworzonej przez restryktazę sekwencji lepkich końców, jeżeli zmieszamy pocięty plazmid z tym naszym genem o odpowiednich lepkich końcach (ich sekwencja tworzona jest przez ukierunkowaną mutagenezę) w efekcie jest duża szansa, że nasz gen zhybrydyzuje z plazmidem i utworzy się kolista cząsteczka plazmidowa ale większa o ten wprowadzony gen. Do tego jeszcze dodajemy ligazę, która łączy nić. I to jest podstawa wszystkich technik w bioinżynierii polegających na wykorzystaniu bakterii do syntezy pożądanego białka. Takie plazmidy możemy co ciekawe wprowadzić do komórek eukariotycznych, w tym ludzkich. Aby gen w plazmidzie uległ ekspresji musi mieć promotor, w komercyjnie stosowanych plazmidach wklonowuje się promotor z wirusa cytomegalii, który cechuje się tym, że jest bardzo silnym induktorem ekspresji genu co zwiększa ilość powstającego pożądanego białka. Dodatkowo taki plazmid może zawierać gen odporności na ampicylinę, wykorzystywane jest to do odróżnienia komórki do której wprowadziliśmy plazmid od tej do której nie wprowadziliśmy – sprawdzamy to antybiotykiem, jeżeli plazmid wszedł do komórki bakteryjnej to jest ona odporna na antybiotyk i przeżywa, a pozostałe giną. Wróćmy teraz do naszej techniki PCR-RFLP ten skrót oznacza właśnie polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych, w technice tej jak sama nazwa wskazuje pierwszym etapem jest namnożenie fragmentu genomu który nas interesuje i poszukujemy mutacji. Przy pomocy odpowiednich starterów namnażamy ten fragment który nas interesuje np. dla B-globiny, po jego namnożeniu mamy taką sytuacje, że w probówce mamy olbrzymią ilość genu dla B-globiny, do tego dodajemy enzymu restrykcyjnego i ten enzym jest np. tak dobrany ze dla człowieka zdrowego w tym fragmencie występuje 1 miejsce restrykcyjne natomiast w przypadku mutacji miejsce zostaje zniesione i enzym tego nie rozpoznaje. Gdy ten pocięty fragment rozdzielimy na żelu to u człowieka zdrowego ten długi gen zostanie podzielony na 2 fragmenty i powstaną 2 charakterystyczne prążki, u człowieka homozygotycznego z mutacją gen nie zostanie pocięty i będziemy widzieli wyłącznie 1 prążek, natomiast u heterozygoty zobaczymy 3 prążki. To technika łatwa, tania i prosta wykonaniu. PCR-ASO – to jest normalny PCR tylko na końcu wykonujemy hybrydyzacje z sondą nukleotydową specyficzną dla danego allelu. PCR STR – identyfikacja osób. RT-PCR (reverse-trascriptase PCR)– wykorzystywana do diagnostyki zakażeń różnymi wirusami, szczególnie wirusami RNA. Ona służy do 2 rzeczy : do wykrywania obcego RNA (najczęściej wirusowego) a w badaniach także do badania ekspresji genu, czyli tego ile mamy kopii mRNA danego genu. Polega to na tym że na początku mamy mRNA, który następnie przy udziale odwrotnej trasnkryptazy jest przepisywany na cDNA, odwrotna transkryptaza ma przy okazji aktywność RNAzy-H dzięki czemu degraduje od razu nici mRNA, następnie do cDNA dołacza się primer i dalej mamy normalną reakcję PCR. (niektóre polimerazy DNA-DNAzależne mają aktywność odwrotnej transkryptazy w ściśle określonych warunkach). Real time PCR – PCR w czasie rzeczywistym, aby wyjaśnić tą metodę muszę się odwołać do zjawiska rezonansu transferu energii fluorescencji – technika ta w skrócie nazywana jest FRET i polega ona na tym, że mamy 2 fluorochromy jeden R(reporter) drugi Q(quencher), oświetlamy tą probówkę światłem o długości fali absorbowanej przez ten nasz fluorochrom R, pod koniec naświetlania fluorochrom R emituje kwant światła o mniejszej długości fali, ten kwant światła jeżeli bardzo blisko niego znajduje się drugi fluorochrom natychmiast jest pochłaniany i tu zachodzi to zjawisko transferu energii rezonansowej ponieważ fluorochom Q ma maksimum absorbcji równy maksimum emisji R. Jeżeli Q to pochłonie to dalej się nic nie dzieje ponieważ on emituje energię w innej postaci. I dopóki R znajduje się blisko Q nie dochodzi do fluorescencji(jest ona wyciszana), a tak jest gdy R i Q znajdują się na 2 końcach sondy nukleotydowej ( kilku-kilkunastu pz). Natomiast w wyniku reakcji PCR(zwykła PCR), różni się tylko tym że dodajemy do mieszaniny tą sondę nukleotydową, która jest znakowana tymi odpowiednimi fluorochromami R i Q. Gdy polimeraza natrafi na ten oligonukleotyd, który może rozpoznać sekwencje na zamplifikowanym fragmencie DNA i ulega z nim hybrydyzacji. I w tym momencie ta polimeraza natrafiając na taki fragment ujawni aktywność nukleazową i spowoduje to rozpad tej sondy nukleotydowej, a jeżeli ta sonda się rozpadnie to w tym momencie R znajduje się bardzo daleko od Q, przekracza to odległość maksymalną do zajścia zjawisk FRET, Q przestaje pochłaniać fotony emitowane przez R i R zaczyna świecić. W związku z tym intensywność fluorescencji w tej metodzie będzie proporcjonalna do ilości zdegradowanych sond(im więcej rozpadów tym zobaczymy to we wcześniejszym cyklu termocyklera). I to jest właśnie zasada metody RealTime PCR. Dzięki temu im mamy na początku więcej DNA lub mRNA tym więcej sond ulegnie zdegradowaniu i będzie większą fluorescencja. Ta technika wchodzi obecnie na rynek diagnostyczny, jest ona relatywnie droga ale co raz więcej wirusów się ją oznacza ponieważ inne techniki umożliwiają tylko stwierdzenie czy ktoś jest zakażony wirusem czy nie a ta technika umożliwia określenie ile kopii wirusa znajduje się w ml krwi. Co nie tylko umożliwia stwierdzenie czy ktoś jest zarażony ale umożliwia także monitorowanie leczenia. Gdy odpowiednio leczymy osobę to ilość tych kopii powinna maleć. Ogólnie technika służy do ilościowo-jakościowej oceny zakażenia wirusami DNA i RNA, możemy wykorzystywać to też do bakterii lub mutacji( gdy ktoś jest homozgygotą dla danej mutacji ma 2kopie tego genu, heterozygotą to ma 1kopie a gdy nie ma mutacji to 0, wiec fluorescencja dla homozytgoty zajdzie we wcześniejszym cyklu niż dla herozygoty a dla normalnego genu nie zajdzie). Wymaga ona specjalnego termocyklera który umożliwia monitorowania fluorescencji w czasie rzeczywistym – 200-300tys. zł.

Regulacja ekspresji genu.

Wiem że proces ten dla państwa znany wiec skupie się tylko na nowych etapach. Jak widzicie regulacja ekspresji genu odbywa się na wielu etapach. Zwrócę dzisiaj uwagę na strukturę chromatyny i regulację epigenetyczną. Tak naprawdę te dwa procesy są ze sobą bardzo spokrewnione i polegają prawie na tym samym. Różnica polega na tym że kontrola epigenetyczna generalnie dotyczy całego genomu i są tylko pewne punkty w trackie naszego rozwoju w którym ta kontrola zachodzi. Takim punktem jest powstanie zygoty i wczesne podziały, natomiast potem stopniowo dochodzi do coraz silniejszej metylacji DNA, która wyłącza niektóre geny i umożliwia różnicowanie się komórek. Natomiast struktura chromatyny też jest procesem zasadniczo epigenetycznym, przy czym tutaj modyfikacji ulega nie tylko DNA, ale także ulegają histony i te modyfikacje są szybsze, odwracalne i umożliwiają także krótkoterminową regulację transkrypcji naszego genu czy fragmentu genomu. Nie mniej jednak te procesy są bardzo zbliżone i będę je omawiał łącznie. Dalsze poziomy regulacji ekspresji genu to regulacja inicjacji transkrypcji, modyfikacja transkryptu(głownie chodzi o wycinanie intronów), transport tRNA, regulacja stabilności genu, kontrola przez regiony mRNA nie ulegające translacji – 3’UTR i 5’UTR. Kontrola epigenetyczna generalnie polega na regulacji ekspresji genu poprzez pewne procesy, które nie zależą bezpośrednio od sekwencji DNA. Polega ona na modyfikacji DNA, modyfikacja wysp CpG – składają się z wielokrotnie powtórzonych fragmentów CG i te miejsca w naszym genomie są szczególnie podatne na modyfikację. Oprócz DNA modyfikacjom mogą ulegać także histony, o ile modyfikacja DNA polega tylko na metylacji cytozyny to też modyfikacje w przypadku histonów są zdecydowanie bardziej bogate, to może być zarówno metylacja, jak i acetylacja oraz inne modyfikacje takie jak przyłączanie reszt cukrowych lub innych form nukleotydów, W efekcie modyfikacji histonów i DNA zmienia się sposób oddziaływania między DNA i histonem. Jeżeli histon ulega metylacji to jego powinowactwo do DNA rośnie, chromatyna staje się bardziej skondensowana i trudniej jest z niej coś transkrybować. Natomiast jeżeli histon ulega acetylacji, a ulega jej najczęściej reszty lizyny tego białka to histon traci swój dodatni ładunek i mniejszą siłą przyciąga ujemnie naładowane DNA – struktura chromatyny ulega rozluźnieniu> enzymy inicjujące transkrypcje mają łatwiejszy dostęp > łatwiejsza transkrypcja(profil acetylacji utrzymywany jest przez enzymy acetylotransferaze - HAT i deacetylotransferazę histonów HDAC, równowaga ta zaburzona w nowotworach – modyfikując aktywność tych 2 enzymów można leczyć nowotwory- inhibitory HADAC), hipoaktywacja HAT –zmniejszenie acetylacji histonów w obrębie antyonkogenów > zmniejszenie ekspresji antyonkogenów > nadmierna proliferacja > nowotwór, hipoaktywacja HDAC> nasilenie acetylacji w obrębie protoonkogenów > unikanie przez komórkę apoptozy> nowotwór . W efekcie metylacji cytozyny w wyspach CpG tworzy się 5-metylocytozyna, ta pochodna powoduje że rożne białka odpowiedzialne za inicjacje procesu transkrypcji tracą powinowactwo do DNA – taki zmetylowany region DNA ulega wyciszeniu. Czasami metylacji ulegają regiony odpowiedzialne za wyciszanie innego genu, w skutek czego ekspresja tego drugiego genu ulegnie nasileniu. Jest to mechanizm filogenetycznie bardzo stary – chroni nas przed wirusami, służy do regulacji genu i chroni przed nadmierną aktywnością transpozonów. Około 3% cytozyn w naszym genomie ulega metylacji, co znaczy że znaczna cześć DNA w normalnej komórce jest wyłączona, co więcej ten proces metylacji zachodzi na pewnych etapach naszego rozwoju, natomiast proces demetylacji zachodzi niezwykle rzadko, tak naprawdę zachodzi tylko na etapie zygoty i kilku podziałów, później masywna demetylacja zasadniczo już nie zachodzi. Metylacja DNA może być procesem nabytym, w wyniku pewnych doświadczeń życiowych np. głód -> dochodzi do zmiany profilu ekspresji naszego genu – gdy żyjemy w regionie ubogim w pożywienie by przekazać naszemu potomstwu informacje o tym np. poprzez sygnał o mniejszej ekspresji jakiegoś genu żeby miało bardziej oszczędny metabolizm, a tą informację można przekazać poprzez profil metylacji naszego genomu (nabyta cecha prowadzi do zmiany nie sekwencji genu ale do zmiany jego ekspresji). Wyspy CpG i kontrola epigenetyczna są także zaangażowane w inne zjawiska – inaktywacji chromosomu X u kobiet, kancerogenezie ( hipermetylacja regionów supresorowych -> wyłączenie ich transkrypcji -> zaczyna brakować białek o funkcjach supresorowych -> przewagę uzyskują czynniki stym. proliferację -> niekontrolowana proliferacja -> nowotworzenie; hipometylacja promotorów proonkogenów -> nasilenie transkrypcji protoonkogenów -> niekotrolowana proliferacja -> nowotworzenie) Stworzono leki przeciwnowotworowe zmieniające profil metylacji genów. Dziedziczenie profilu metylacji jest niezależne od dziedziczenia mendlowskiego i polega generalnie na tym, że są dziedziczone pewne nabyte informacje, najczęściej pochodzące od matki (po ojcu rzadziej gdyż DNA ojca ulega szybko masywnej hipometylacji co powoduje, że generalnie na wczesnych etapach rozwoju dochodzi głównie do ekspresji genów ojcowskich, natomiast regulacje tego wszystkiego stanowi genom matczyny ) Prowadzi to też do tego że występuje tzw. ekspresja monoalleliczna, w naszym genomie większość genów występuje w 2 kopiach (1 po ojcu, 2 po matce) i w zależności od tego jak one są różnicowo zmetylowane dochodzi do ekspresji tylko jednego z nich. Jak wspominałem poprzednio we wczesnych etapach dochodzi głównie do ekspresji alleli ojcowskich, toteż większość czynników wzrostu i czyn. reg gospodarkę energetyczną (cukorowo-tłuszczową) będziemy dziedziczyć po ojcu. Natomiast to w jakim stopniu one będą włączone będziemy dziedziczyć w postaci profilu metylacji po matce. Zmiany w tym prawidłowym imprintingu mogą prowadzić do różnych chorób. W regulacji epigenetycznej bierze udział kilka enzymów : metylazy – enzymy przenoszące resztę metylową na akceptor np. cytozynę, mamy kilka typów metylaz, metylacja DNA umożliwia różnicowanie komórek gdyż wyłącza niepotrzebne dla danej komórki geny, wyłączanie polega na metylacji cytozyny w regionie promotora w efekcie polimeraza nie rozpoznaje promotora i gen nie jest transkrybowany, zostaje jednak rozpoznane przez białka wiążące zmetylowane cytozyny/zmetylowane DNA (MTD) w efekcie przyłączają się one do regionu promotorowego i nie ma miejsca dla enzymów inicjiujących transkrypcje – również uniemożliwia to ekspresję, dla nas iteresujące są klasy I i III metylaz, klasa III jest odpowiedzialna za metylacje genową i są to metylazy ulegające ekspesji w trakcie rozwoju embrionalnego, klasa I – utrzymują efekt metylacji w późniejszych etapach, przy podziale odtwarzają profil metylacji komórek potomnych – zapobiega odróżnicowaniu; demetylazy - enzym TET , powoduje przekształcenie 5-metylocytozyny w 5-hydroksymetylocytozyne i nukleotyd jest rozpoznawany jako nieprawidłowy przez enzymy naprawcze i zamieniany ponownie na cytozynę – w ten sposób tak jakby na około DNA może ulegać demetylacji (reaktywacja genu), tym enzymem który bierze udział w naprawie jest enzym AID, który powoduje dalsze przekształcenie 5-hydroksymetylocytozyny w 5-metylouracyl, który jest wycinany. Enzym TET ma kluczowe znaczenie dla komórek macierzystych. Enzym ten ulega tylko częściowej ekspresji w niektórych typach komórek oraz w komórkach nowotworowych; może zachodzić także pasywna demetylacja DNA związna ze spontaniczną demetylacją cytozyny na skutek termolabilności, demetylacja taka może brać udział w mutagenezie, wyspy CpG stopniowo zamieniają się w TpG albo komplementarne APC; demetylacja u człowieka dorosłego jeżeli zachodzi to nie zachodzi na poziomie genomowym tylko na poziomie loci; ekspresja enzymu TET wykrywana jest w komórkach multipotencjalnych- demetylwane są tam sekwencje kodujące markery odróżnicowania komórki. Metylowane DNA jest bardzo obiecującym markerem nowotworowym, ponieważ komórki nowotworowe mają pewną tendencję do rozpadania się – uwalniania swojego materiału genetycznego, wykrywanie hipermetylowanych promotorów genów supresorowych – świadczy to o rozwoju nowotworu. Kolejne mechanizmy regulujące ekspresje genów : występowanie sekwencji wzmacniających >nasilenie ekspresji genów, wyciszacze > obniżenie ekspresji genów, działają nawet na kilka mln pz więc mogą obejmować nawet kilkanaście genów. Za odizolowanie genu od działania wzmacniacza/wyciszacza odpowiada kolejna grupa sekwencji – izolatory. Wzmacniacze – występują w odległości kilkuset-kilku tysięcy pz przed wzmacnianym genem/grupą wzmacnianych genów, powodują bardzo niespecyficzną regulację aktywności transkrypcyjnych, generalnie działają one na fragment DNA w którym się znajdują, a lokalizacja wzmacnianego genu jest dowolna, dzieje się tak dlatego że struktura DNA jest strukturą przestrzenną i jak ją sobie pozwijamy to może się okazać że sekwencja nukleotydowe które w jednym wymiarze – sekwencji nukleotydów znajdują się bardzo daleko od siebie w rzeczywistości znajdują się bardzo blisko siebie i w efekcie taki wzmacniacz może znajdować się tuż obok genu którego ekspresję będzie regulował i w tym momencie to ułożenie wzmacniacza względem genu staje się zupełnie normalne, nieważna 1wymiarowa struktura DNA, ważne żeby w 3D te dwa odcinki znajdowały się odpowiednio blisko siebie, generalnie ze wzmacniaczami wiążą się pewne białka, które są innymi białkami niż czynniki transkrypcyjne które wiążą się z regionem promotorowym i powodują niespecyficzne wzmacnianie rożnych genów, wzmacniacze ułatwiają przyłączenie czynn. Inicjujących transkrypcje np. do kasety TATA. Wyciszacze – dokładnie odwrotna funkcja niż wzmacniacze, uniemożliwiają dostęp czynników transkrypcyjnych do promotora co skutkuje hamowaniem ekspresji genu. Aby to wszystko nam się nie poplątało potrzebujemy izolatory- sekwencje które nam izolują różne części genomu, które są tranksrybowane oddzielnie, są to najczęściej krótkie fragmenty DNA składające się z kilkunastu nukleotydów i powodują one wyłączenie działania znajdujących się w okolicy wzmacniaczy i wyciszaczy, w efekcie dany odcinek DNA jest regulowany zupełnie oddzielnie, z tymi izolatorami są związane białka CTCF to jest białko które zawiera tzw. palce cynkowe (11motywów) a te place cynkowe to nic innego jak pewna struktura w białku odpowiedzialna za rozpoznawanie pewnych specyficznych sekwencji DNA, dzięki tej strukturze te białka CTCF mogą się z DNA łączyć, a łączą się dokładnie tam gdzie znajduje się izolator, co ciekawe sekwencje te są wrażliwe na metylację w efekcie jeżeli zajdzie metylacja izolatora to odpowiednie białko nie rozpozna takiej sekwencji w w efekcie izolator przestaje działać, prowadzi to to wzrostu lub spadku ekspresji danego genu, izolatory mogą także zmieniać 3wymiarową strukturę DNA uniemożliwiając dostęp czynnikom transkrypcyjnym – blokada ekspresji genu. Przejdźmy teraz do mRNA i jego obróbki : nasze mRNA musi dojrzewać i polega to na : wycinaniu sekwencji intronowych, dodawaniu czapeczki – ochrona przed egzonukleazami, ogonka – poliadenylacja 5’- zwiększa stabilność, poliadenylacja wykorzystywana jest także w metodach biologii moleularnej – jeżeli chcemy stworzyć cDNA z mRNA to w tym momencie możemy wykorzystać primer komplementarny do naszego ogonka czyli tzw. primer oligo-dT, oprócz tego bardzo ważne regiony niekodujące 5’UTR i 3’UTR . W regionie 5’UTR występuje m.in. czapeczka z 7-metyloguanozyny, która zapewnia stabilność i bierze udział w regulacji translacji natomiast w regionie 3’UTR występują inne elementy regulujące stabilność transkryptu – elementy odpowiedzi na żelazo oraz ogon poliA. Poszczególne egzony kodują kolejne domeny białka o charakterystycznej aktywności – utrata eksonu=utrata domeny. Proces wycinania intronów a łączenia eksonów nazywamy splicingiem, jest to mechanizm niezwykle precyzyjny. W wycinaniu intronów wykorzystywanych jest kilka mechanizmów, bazują one głownie na wykrywaniu specyficznych sekwencji znajdujących się na granicy inton-ekson i w tym wycinaniu pomagają kompleksy małych jądrowych RNA = snRNA, które łączą się z odpowiednimi białkami o właściwościach katalitycznych i razem ten kompleks nazywa się SNRNP. W kolagenozach u człowieka dochodzi do biosyntezy przeciwciał które mogą być skierowane przeciwko tym białkom, funkcja tych rybonukleoprotein będzie więc zaburzona -> nieprecyzyjne wycinanie intronów -> powstanie nowych białek (częste u osób z chor. Autoimmun). Intron ma charakterystyczne sekwencje – zawsze rozpoczyna się od pary GU(100%) a kończy AG ( AA/GA), tego typu sekwencje flankują nam sekwencje intronowe, dodatkowo egzony też kończą się pewnymi charakterystycznymi sekwencjami (jednak mniejsza swoistość). Splicing RNA może być sterowany przez same introny o spec. konformacji- rybozymy – enzymy z RNA o aktywności hydrolitycznych = autokataliza. U człowieka w wycinaniu intronów pomaga nam gRNA, które zawiera pewne sekwencje komplementarne do sekwencji w której następuje wycinanie intonów, to gRNA może więc wchodzić w skład specjalnego mechanizmu który jest odpowiedzialny za wycinanie intronów różnych klas – mechanizm białkowy, bardziej precyzyjny. Spliceosom rozpoznaje granice intron-ekson, następuje wycięcie ‘lassa’ a pozostałe sekwencje są ze sobą łączone. W ten sposób pierwotny transkrypt dojrzewa i do cytoplazmy dostaje się wyłącznie mRNA pozbawiony sekwencji intronowych. Istnieje również alternatywny splicing w efekcie mogą powstawać różne białka mimo transkrypcji tego samego genu, alternatywny splicing jest tkankowo specyficzny – precyzyjnie regulowany. Zaburzenia alt. splicingu obserwujemy w kom.nowotworowych – powstają nowe białka, często toksyczne które mogą być markerem procesu nowotworowego.