Anna Matyja

Ewelina Honkisz

Biotechnologia IV

WARUNKI ŚRODOWISKOWE A ODPORNOŚĆ ORGANIZMU PTAKÓW –

WPŁYW KLIMATU, SZCZEPIENIA, IMMUNOMOSTYMULATORY, IMMUNOMODULATORY

W Polsce przemysł drobiarski zaczął rosnąć w siłę pod koniec lat 50-ych. Do lamusa przeszedł obraz bab wiejskich skubiących pierze, z którymi to dotychczas kojarzyło się wykorzystanie drobiu, natomiast na rynku zaczęły pojawiać się brojlery. Ta nowo rozwijająca się wówczas gałąź przemysłu, obecnie produkuje ok. 40 bilionów ptaków rocznie na całym świecie. Jednym z najważniejszych i spędzających sen z powiek problemów jest spadek produkcyjności wywołany chorobami. Na prawidłowy stan stada drobiu ma wpływ wiele czynników. Należą do nich m.in. organizacja chowu, żywienie, program szczepień profilaktycznych, a co najważniejsze, prawidłowy rozwój mechanizmów obronnych, czyli układu immunologicznego ptaków. Wszelkie zakłócenia tych mechanizmów mogą mieć podłoże zakaźne (infekcje wirusowe) lub nie zakaźne (mikotoksyny, stres, złe warunki chowu). W/w czynniki indukują stan immunosupresji u ptaków, co może przyczynić się do zwiększonej śmiertelności w stadzie, niejednolitego rozwoju ptaków, oraz mogą wpływać na podwyższony wskaźnik wykorzystania paszy.

Hodowle brojlerów to bardzo intensywnie rozwijająca się gałąź gospodarki rolnej, w której bardzo często intensyfikacji produkcji sprzyja dodatkowo rozwój niebezpiecznych patogenów. W celu ograniczenia infekcji można stosować antybiotyki (jako dodatek do premiksów, składnik gotowych mieszanek przemysłowych lub koncentratów białkowych). Profilaktyczne stosowanie antybiotyków daje szereg korzyści zarówno produkcyjnych jak i zdrowotnych. Jednak długotrwałe żywienie zwierząt niskimi dawkami antybiotyków sprzyja kształtowaniu się opornych szczepów bakteryjnych. Należy jeszcze zwrócić uwagę na fakt, że tylko niektóre antybiotyki (np. jonoforowe obecnie stosowane w Polsce) nie wymagają okresu karencji, podczas gdy np. kokcydiostatyki wymagają 5-dniowego okresu karencji, gdyż przechodzą do organizmu ptaka. Zatem nie bez powodu w światowych trendach żywienia zwierząt dąży się do eliminacji antybiotyków paszowych, co jednocześnie wywiera nacisk na szukanie alternatywnych metod w walce z infekcjami u drobiu. Również z myślą o silnej kampanii na rzecz zdrowej żywności, także tej tzw. ekologicznej podkreśla się często znaczenie szczepionek jako nowoczesny sposób w walce o długotrwałą ochronę organizmu ptaków. Antygeny są tym niemal najważniejszym składnikiem szczepionek, gdyż to one dają odporność czynną, ale i również charakteryzują się odmienną immunogennością. Z tego względu małe peptydy czy oligosacharydy o małej immunogenności są łączone z immunogennym białkiem (szczepionki skoniugowane) lub dodatkowym składnikiem szczepionki jest wówczas adiuwant. Najczęściej stosowanymi adiuwantami w licencjonowanych szczepionkach są sól aluminiowa lub emulsje olejowe. Pierwszy z nich jest powszechnie stosowany, bo jest bezpieczny. Jednak studia porównawcze pokazują, że jest to dość słaby adiuwant (Gupta RK. Aluminum compounds as vaccine adjuvants.) – nie indukuje odpowiedzi komórkowej w sposób dostateczny i może wywołać reakcje alergiczne. Natomiast adiuwanty na bazie oleju indukują efekty uboczne i w miejscu iniekcji mogą wywołać zapalenie lub owrzodzenie. Jest to zjawisko bardzo niepożądane w produkcji rolnej ze względu na wymaganą, dobrą jakość mięsa. Między innymi to, to kryterium stawia wysokie wymagania szczepionkom i mobilizuje do poszukiwania nowych, lepszych adiuwantów. Obecnie w toku są prace nad wprowadzeniem cytokin w miejsce dotychczas stosowanych adiuwantów.

Aby stworzyć dobry adiuwant należy znać molekularne podstawy mechanizmu jego działania. Ich poznawanie stało się znacznie bardziej „jasne” w momencie odkrycia receptorów Toll-like (TLR). Rozpoznają one unikalny wzór molekularny patogenu (PAMP), a następnie aktywują makrofagi do wytwarzania cytokin prozapalnych. Ssacze receptory TLR są dosyć obszernie opisane w literaturze naukowej. W celu poznania ptasich ortologów, w znaczący sposób może przyczynić się odczytanie genomu kury w 2004 roku. Już teraz scharakteryzowano kilka cytokin, które mogą występować w charakterze adiuwantów: IFN-ɤ, IFN-α, ChIL-1β I cMGF.

Początki rozwoju szczepionek sięgają wieku XVIII. Edward Jenner, uważany za ojca immunologii, jako pierwszy wykonał szczepienie przeciwko ospie prawdziwej. Niedługo po nim kolejne ważne kroki postawił Ludwig Pasteur odkrywając w 1878 roku ptasią cholerę (Pasteurella multocisa). Kolejna odkryta szczepionka miała zastosowanie przeciwko chorobie Mareka (choroba nowotworowa wywołana przez herpesvirus) i był to pierwszy przykład szczepionki użytej na skalę światową (Purchase, 1973). Choroba Mareka znacznie zdominowała przemysł drobiarski w l. 50-ych i 60-ych XX w., co bardzo obciążyło finansowo ten przemysł. Pierwotna wersja szczepionki bazowała na atenuowanym wirusie i w 1970 roku, po raz pierwszy została dopuszczona do użytku w UK. Dosyć szybko uległa ona modyfikacji, która polegała na zastosowaniu indyczego odpowiednika wirusa z grupy herpes (HVT: Witter i wsp., 1970). Ogólna akceptacja i spektakularny sukces sprawił, że była ona stosowana na całym świecie (Witter, 2001). Wszystkie komercyjne tuczniki i nioski były szczepione w 1 dniu po wykluciu. Niestety w latach 80-ych ukazał się raport o wybuchy MD (Marek’s disease) w jednym z szczepionych stad. W odpowiedzi na zwiększającą się liczbę wybuchów epidemii, wprowadzano coraz to nowsze rozwiązania. Wyprodukowano tzw. szczepionki biwalentne – na bazie nieonkogennego serotypu wirusa MD w kombinacji z jego „indyczym” odpowiednikiem. Kolejnym pomysłem był automatyczny system szczepienia INOVOJECT - masowa aplikacja szczepionek w USA między 17 a 18 dniem inkubacji (Sharma i Burmester, 1982; Sharma i Witter, 1983).

Po wielu latach teraz wiadomo, że wprowadzanie coraz bardziej agresywnych form szczepionek sprzyjało zwiększaniu się wirulencji MDV. Nie jest to jedyny przykład „złośliwej” ewolucji wirusa na zastosowane szczepionki (analogicznie wirus zakaźny zapalenia Torby Fabrycjusza). Z jednej strony ekorozwój przemysłu drobiarskiego wymaga rzetelnych metod kontroli wszelkich zagrożeń (infekcji),

z drugiej jednak polityka konsumencka wywiera nacisk na redukcję chemioterapeutyków w żywieniu zwierząt, co nieuchronnie kieruje nasze spojrzenie na rozwój profilaktycznych szczepień. Jest to jeden z podstawowych powodów, dla których szczepionki powinny być bezpieczne, skuteczne, termostabilne i zdolne do stymulacji pamięci immunologicznej. Na obecnym etapie badań można stwierdzić, że technologia szczepionek rekombinowanego DNA daje nadzieje na szerokie możliwości jej zastosowania w profilaktyce. Podczas gdy konwencjonalne szczepionki pobudzają do klonalnego rozrostu komórki T i B, to rekombinowane mogłyby polaryzować tą odpowiedź w kierunku Th1 lub Th2, napędzając układ immunologiczny do produkcji przeciwciał lub stymulować odpowiedź komórkową, która czasem ma znaczenie decydujące w rozwoju choroby. Bardzo pożądane byłoby stworzyć szczepionkę będąca kombinacją elementów molekularnych patogenu i genów kodujących cytokiny gospodarza. Ważne jest również to, aby generować szczepionki, które nie przyczynią się do zwiększenia zjadliwości patogenu. W tym celu należałoby dokładnie zbadać mechanizm molekularny MDV, poznać w jaki sposób wirus atakuje limfocyty i zainicjować odpowiedź układu immunologicznego zanim wirus zacznie się namnażać w komórkach B lub T. Zatem pożądane są szczepionki, które zablokują replikację patogenu, a nie tylko samą infekcję. Studia modelowe pokazały, że hamowanie tylko samej infekcji sprzyja zwiększaniu się wirulencji patogenu (Gandon i wsp., 2001).

Kompleksowe działania profilaktyczne to nie wszystko, co może wpływać na dobry stan zdrowia organizmu ptaków. Bardzo ważna jest również prewencja, której głównym zadaniem jest dbanie o dobre warunki bytowe. W dalszym ciągu naszych rozważań na temat odporności ptaków, skupimy się na jednym z czynników środowiskowych jakim jest klimat. Zastanowimy się nad jego wpływem na kondycję fizyczną ptaków (szansa przeżycia) oraz na rozmiar narządów układu immunologicznego.

W pierwszym z doświadczeń ptaki były wystawione na zmienność warunków klimatycznych w obszarze Północnego Atlantyku (oscylacja północno – atlantycka NAO). Wśród 14 gatunków ptaków zanotowano korelację pomiędzy masą śledziony a zmianami NAO (Moller i Eritroe, 2003). Ptaki, u których NAO wpływał pozytywnie, charakteryzowały się małymi rozmiarami śledziony w stosunku do masy ciała. Natomiast badana grupa z reakcją negatywną, miała znacznie powiększone rozmiary śledziony i jednocześnie bardziej cierpiała z powodu pasożytów. Podsumowując, zmiany NAO skorelowane z rozmiarami śledziony, modulowały naturalną selekcję pojmowaną tutaj jako chorobę pasożytniczą.

W innym doświadczeniu zbadano wpływ klimatu w centralnej i północnej części Sudanu na nowo wyklute brojlery (Ali, Elzubeir, Elhadi, 2008). Wykorzystano 56 komercyjnych brojlerów Lohman, które podzielono na dwie grupy doświadczalne – w sezonie letnim i zimowym. W 2 i 13 dniu po wykluciu immunizowano je 10% SRBC’s, a następnie w dniu 13 i 20 wykonano test hemaglutynacji. Wyniki były następujące: miano przeciwciał anty-SRBC w odpowiedzi na drugą immunizację było zdecydowanie wyższe w okresie zimowym w stosunku do letniego. Co ciekawe w odpowiedzi na pierwszą iniekcję 10% SRBC’s miana zarówno w okresie letnim jak i zimowym były niemal identyczne. Natomiast masy narządów limfatycznych (śledziona, grasica, torba Fabrycjusza) w 12 i 20 dniu były znacznie mniejsze w okresie letnim w stosunku do okresu zimowego. Należy tu jeszcze podkreślić, że średnie temperatury w Sudanie w okresie letnim mogą dochodzić nawet do 42°C, co może wywołać stres termiczny u kurcząt. Z przeprowadzonych badań wynika, że okresy gorąca mają znaczący wpływ na spadek odporności, co przejawia się supresją IgG. Nie bez znaczenia pozostaje również czas trwania ekspozycji na stres termiczny i przerw między tą ekspozycją (Siegel i Latimer, 1984). Porównywalne wartości miana przeciwciał po pierwszej immunizacji można wytłumaczyć opóźnieniem reakcji immunologicznej na stres termiczny. Innym również przekonującym argumentem jest obecność resztkowego pęcherzyka żółtkowego. Zawarta w nim witamina E „usprawnia” mechanizmy obronne po iniekcji SRBC (Ferket i wsp. 1993; Gore i Qureshi, 1997). Może to być decydujące w walce ze stresem termicznym przez pierwsze 5 dni po wykluciu.

W badaniach nad stresem termicznym bardzo często jako wskaźnik stresu używa się ilość neutrofili w stosunku do limfocytów. Znaczny wzrost liczby neutrofili wskazuje na korelację pomiędzy stresem termicznym a nieswoistą odpowiedzią immunologiczną (aczkolwiek relacja ta nie dotyczy układu dopełniacza i naturalnych przeciwciał – komponent układu odporności wrodzonej). Jednak dane na temat indukcji specyficznej odpowiedzi humoralnej wywołanej stresem termicznym nie są jednolite. Doniesienia w prasie naukowej wskazują na wzrost (Heller i wsp., 1979) lub spadek (Donker i wsp.,1990) miana przeciwciał w wyniku ekspozycji na wysoką temperaturę (41-42°C). Te różnice mogą wynikać z odmiennego czasu trwania ekspozycji na stres termiczny, indywidualnego systemu żywienia drobiu, czy obecności innych stresorów w tym samym czasie. Wspólne natomiast jest jedno odkrycie, które obala wcześniejsze mity mówiące o tym, że chroniczny stres wywołuje efekt immunosupresyjny, podczas gdy ostry i krótkotrwały stres wzmacnia odpowiedź immunologiczną (Dhabhar i Viswanathan, 2005).

Kolejnym ważnym zagadnieniem w udoskonalaniu rozwoju współczesnej produkcji drobiarskiej jest immunomodulacja, która ma na celu wprowadzenie zmian w systemie odpornościowym czynnikami, które będą stymulowały jego aktywność na wybranym poziomie – stymulacja pozytywna i negatywna. Coraz częściej jest to bardzo ważne narzędzie mogące pomóc obniżyć zapadalność na choroby oraz śmiertelność zwierząt. Czynniki immunomodulujące zostały podzielone na dwie kategorie. Do pierwszej zaliczamy czynniki fizjologiczne (endogenne), które zwykle kontrolują reakcję immunologiczną a także ich syntetyczni agoniści lub antagoniści. Są to hormony, cytokiny, niektóre związki zawarte w pożywieniu i niektóre leki. Drugą grupę stanowią czynniki działające immunogennie (wywołują reakcję układu odpornościowego). Najczęściej stosowanym immunomodulatorem w produkcji zwierzęcej jest Lewamizol, który stymuluje różnicowanie limfocytów T oraz zdolność rozpoznawania obcych antygenów.

MODULATORY FIZJOLOGICZNE

Hormony

Najlepiej opisanymi hormonalnymi immunomodulatorami są kortykosteroidy. W dużym stężeniu wpływają hamująco na komórki systemu odpornościowego. Powodują obniżenie liczby komórek NK (natural killer) oraz limfocytów CD8 i IgM. Obniżają również poziom konkanawaliny A, która indukuje produkcję IL-2 i INF-gamma przez limfocyty (Isobe i Lillehoj, 1992, 1993). Hormon adrenokortykotropowy obniża liczbę krążących we krwi limfocytów CD4 i CD8 (Trout i Mashaly, 1994). Podsumowując, hormony osi podwzgórze-przysadka-nadnercza są immunomodulatorami u drobiu wpływającymi na obniżenie odporności na choroby.

Cytokiny

Cytokiny wpływają na wzrost, dojrzewanie oraz proliferację komórek biorących udział w odpowiedzi immunologicznej. Mają one również wpływ na inne fizjologiczne procesy, takie jak gojenie się ran, wzrost i zdolność reprodukcji, jednakże ciągłe podawanie egzogennych cytokin nie wpływa znacząco na podniesienie odporności na choroby. Zapalne cytokiny, takie jak IL-1, INF-ɤ i IL-6 oraz TNF-α wykazują antagonistyczne działanie w kierunku procesów wzrostowych i reprodukcyjnych (Klasing i Johnstone, 1991).

Składniki pokarmowe

Duży wpływ na odporność ma dieta - składniki odżywcze oraz ich produkty przemiany materii. Szczególną rolę odgrywają kwasy tłuszczowe, głównie omega-3 i omega-6, co dotyczy zarówno całkowitej ilości tych związków, ale także ich wzajemnego stosunku. Przedstawicielem kwasów tłuszczowych omega-6 jest kwas linolowy, który jest w organizmie metabolizowany do kwasu arachidowego, który wbudowuje się w błony komórkowe, a ponad to jest prekursorem eikozanoidów: prostaglandyn, tromboksanów i leukotrienów. Tempo przemian kwasu arachidowego jest modyfikowane zależnie od ilości w diecie kwasów omega-3. Stosunek kwasów omega-3/ omega-6 determinuje tempo i typ przemian eikozanoidów w leukocytach i w komórkach pomocniczych, co moduluje reakcję immunologiczną. Podawanie rosnącym kurczętom rasy Leghorn oleju rybiego, który jest bogaty w kwasy omega-3 rozszerzyło reakcję przeciwciał po immunizacji kurczą przy użyciu SRBC’s (sheep red blood cells), ale obniżyło tempo podziałów limfocytów (Fritsche i wsp., 1991). Uwalnianie IL-1 u kurcząt karmionych dietą bogatą w kwasy omega-6 znacząco wzrosło w porównaniu do kurcząt, którym podawano pokarm bogaty w kwasy omega-3. Białka ostrej fazy są również podwyższone podczas stosowania diety o wysokim stosunku kwasów omega-6 do omega-3 (Korner i Klasing, 1995).

Ważna rolę w zakresie immunomodulacji odgrywają też inne składniki takie jak witaminy: C, D, E i A (Sklan i wsp., 1994; Nockles, 1998). Witaminy C, E i A jako antyoksydanty wywierają pozytywny efekt stabilizując błonę komórkową leukocytów, co daje im lepsza zdolność przeżycia w obliczu zetknięcia z czynnikami utleniającymi znajdującymi się w miejscu zapalenia. Witamina E obniża uwolnienie PGE2 i moduluje uwolnienie cytokin (Halevy i wsp., 1994).

Komórki układu odpornościowego ze względu na intensywne podziały charakteryzują się wysokim zapotrzebowaniem na energię i białko. Wykazano, że niedobór białka ogólnego oraz energii powoduje zmniejszenie ogólnej ilości leukocytów a także pogarsza efektywność humoralnej reakcji immunologicznej (Glick B., Day E. J., Thompson D., 1988). Do szczególnie ważnych aminokwasów w prawidłowym funkcjonowaniu należy arginina i metionina. Niedobór metioniny powoduje zaburzenia wydzielania Il-1 w odpowiedzi na czynnik immunogenny (Klasing K. C., Barnes D. M., 1981). Arginina jako prekursor tlenku azotu (czynnik bakteriobójczy) odgrywa ważną rolę w aktywności makrofagów.

Mikroelementy

Mają znaczący wpływ na prawidłowe funkcjonowanie układu odpornościowego. Stanowią one kofaktory wielu enzymów biorących udział w syntezie poszczególnych składników komórek, a także wchodzą w skład układów antyoksydacyjnych w komórkach. Szczególnie ważnym mikroelementem jest cynk, który jest niezbędny do prawidłowego rozwoju narządów wchodzących w skład układu odpornościowego. Niska zawartość cynku w makrofagach obniża ich fagocytarną aktywność i właściwości bakteriobójcze w stosunku do E.coli (Gershwin M. E., Keen C. L., Mareshi J. P., Fletcher M. P., 1991.). Korzystny wpływ ma również selen, który stymuluje produkcję limfocytów T (Leng L., 2003).

Immunosupresory

Do tej grupy należą związki, które zaburzając prawidłowe funkcjonowanie układu odpornościowego, powodują obniżenie odporności. Zaliczamy tutaj substancje antyżywieniowe, które mogą znaleźć się w paszy w wyniku zanieczyszczeń powstałych w toku produkcji lub przechowywania pasz. Najpoważniejszy problem stanowią mykotoksyny. Aflatoksyna hamuje powstawanie przeciwciał ( Thaxton i wsp., 1974 ), podnosi podatność kurcząt na infekcje wirusowym zapaleniem kaletki maziowej ( Chang i Hamilton, 1982 ). Toksyna T2 i ochratoksyna powoduje zwiększoną wrażliwość na zakażenia Salmonella sp. (Boonchuvit i wsp., 1975; Ellisalde i wsp., 1994 ). Mykotoksyna produkowana przez Fusarium equiseti działa supresyjnie na układ immunologiczny, powoduje u ptactwa dyschondroplazię piszczeli ( Chu i wsp., 1998; Wu i wsp., 1993 ). Badania wykazują, że Fusarium sp. Wystepuje często w płatkach zbożowych i wywiera hamujący efekt na układ odpornościowy ( Chu i wsp., 1995 ). Inne niebezpieczeństwo stanowi Thiram, fungicyd, który do organizmu dostaje się wraz z pasza. Działa on supresyjnie na układ immunologiczny i powoduje uszkodzenia kości.

Literatura

1. T.F. Davison “The immunologists’ debt to the chicken.”,

British Poultry Science (2003) 44: 6–21

1. M.Asif, K.A.Jenkins, L.S.Hilton, W.G.Kimpton, A.GD.Bean, J.W.Lowenthal

“Cytokines as adjuvants for avian vaccines.”,

Immunology and Cell Biology (2004) 82: 638–643

1. L. Star, M. G. B. Nieuwland, B. Kemp, and H. K. Parmentier

“Effect of Single or Combined Climatic and Hygienic Stress on Natural and Specific Humoral Immune Competence in Four Layer Lines.”,

Poultry Science (2007) 86:1894–1903

4. AP. Moller, J. Erritroe “Climate, body condition and spleen size in birds.”,

Laboratoire de Parasitogie Evolutive

4. O.H.A. Ali, E.A. Elzubeir, H.M. Elhadi

“Effect of season on the immunity of newly hatched broiler. Chicks reared in arid-hot climate.”, Pakistan Journal of Biological Science 11 (2): 318-320, 2008

4. Enrique Montiel „Znaczenie immunosupresji w towarowym chowie drobiu: przyczyny I skutki. Ocena układu immunologicznego u drobiu w chowie towarowym.”,

Wieś Jutra 2000.01, 29-31

4. Krzysztof Chudzik „Wpływ wybranych czynników immunosupresyjnych na produkcję drobiarską.”, Przegląd Hodowlany 2005.73.05, 25-27

5. K. C. Klasing “Immunomodulation in poultry.”

Avian Immunology (1996); 327-339

9. M. E. Cook „Diet-induced immunosuppression.”

Poultry Immunology (1996); 317-328