Krzywa wzrostu stacjonarnej hodowli Escherichia coli i represja glukozowa (c.d.)

1. Wyznaczanie miana dla hodowli E. coli wysianej na płytki na poprzednich ćwiczeniach

Zakładając, że pojedyncza kolonia powstaje z jednej komórki bakteryjnej można określić liczbę żywych komórek obecnych w 1 ml badanej hodowli (miano bakterii) posługując się następującym wzorem:

N = n * 10^R * v/1000, gdzie:

N - miano hodowli bakteryjnej (liczba bakterii w 1 ml)

n – liczba kolonii, które wyrosły na płytce przy danym rozcieńczeniu

10^R - rozcieńczenie hodowli

v – objętość wysianej zawiesiny bakteryjnej [µl]

Wykonanie: obliczenie kolonii, które wyrosły na płytce, a następnie wyliczenie miana przy pomocy powyższego wzoru

1. Oznaczanie ilości białka metodą Lowry’ego w próbkach pochodzących z hodowli

Wykonanie:

1. Pobrać po 0,5 ml próbek pobranych z hodowli i dodać do nich 2,5 ml roztworu C

2. Mieszaniny worteksować, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 min

3. Dodać 0,25 ml roztworu D i ponownie worteksować

4. Po 20 – 30 min odczytać absorbancję przy λ= 750 nm

Analogicznie do powyższego przepisu należy przygotować krzywą wzorcową dla następujących stężeń białka: 0,5 µg- 50 µg/ml.

1. Oznaczanie aktywności β-galaktozydazy

Wykonanie:

1. Przygotować probówki aglutynacyjne i do każdej z nich dodać 1 ml odpowiedniej hodowli (do probówki kontrolnej dodać 1 ml pożywki M9), a następnie umieścić probówki w łaźni lodowej

2. Do każdej probówki dodać kroplę (30 µl) toluenu, wytrząsać i wstawić ponownie do łaźni lodowej z toluenem

3. Probówki wstawić do łaźni wodnej o temp. 37°C i inkubować 30 min, wytrząsając co pewien czas

4. Dodać do probówek po 0,2 ml roztworu ONPG (zanotować czas dodanie do pierwszej probówki) i inkubować w 28°C przez 20 min

5. Zatrzymać reakcję przez dodanie 0,5 ml 1 M węglanu sodowego

6. Zmierzyć gęstość optyczną w każdej probówce przy λ=420 i λ= 550 nm używając jako kontroli probówki z pożywką M9

7. Aktywność β-galaktozydazy obliczyć ze wzoru:

Akt. Β-galaktozydazy = [OD₄₂₀- (1,65 * OD₅₅₀)]/[czas inkubacji (min)* 0,0075]

1. Zestawienie otrzymanych wyników

• Wykres zależności OD₅₅₀ od czasu hodowli bakterii

• Wykres zależności miana od czasu hodowli bakterii

• Wykres zależności aktywności β-galaktozydazy od czasu hodowli bakterii

• Wykres zależności ilości białka od czasu hodowli bakterii

Materiały i odczynniki:

- spektrofotometr

- pipety automatyczne

- końcówki do pipet

- łaźnia lodowa

- łaźnia wodna o temp. 37°C

- łaźnia o temp. 28°C

- worteks

- probówki aglutynacyjne

- 10 ml pożywki M9

- toluen

- ONPG (4 mg/ml buf. Z)

- 1 M węglan sodowy

- Roztwór A, 100 ml: 0,5 g CuSO₄ x 5 H₂O, 1 g Na₃C₆H₅O₇( x 2 H₂O), dopełnić H₂O dest. do 100 ml

- Roztwór B, 1 l: 20 g Na₂CO₃, 4 g NaOH, dopełnić H₂O dest. Do 1 l

- Roztwór C, 51 ml: 1 ml r-ru A, 50 ml r-ru B

- Roztwór D, 20 ml: 10 ml fenolowego odczynnika Folin-Ciocalteu, 10 ml H₂O dest.

- albumina o stężeniu 1 mg/ml