27. Koniugacja, transdukcja, transformacja. 

Transformacją nazywamy przekazanie genów w formie rozpuszczalnego DNA wyekstrahowanego lub uwolnionego z komórki dawcy za pomocą innych metod. Ten sposób przekazania genów między bakteriami został wykryty jako pierwszy i historycznie ma największe znaczenie.

W 1928 r. Griffith opisał zmianę bezotoczkowego szczepu R Streptococcus pneumoniae

w szczep S posiadający otoczkę. Wstrzyknął on myszom małą ilość niezjadliwych komórek R wraz z zabitymi termicznie komórkami S. Po pewnym czasie można było izolować z myszy zjadliwe ziarniaki mające otoczki typu SIII.

Metody transformacji:

1) wykorzystanie naturalnej zdolności (kompetencji) niektórych gatunków bakterii do pobierania obcego DNA;

np. u: Bacillus, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus

W ten sposób mogą być przekazane cechy prototrofizmu lub oporności na antybiotyki.

Kompetentne komórki mają zmienione warstwy powierzchniowe, ściana komórkowa

staje się porowata, aktywność zewnątrzkomórkowych enzymów zwiększa

się i następuje synteza „czynnika kompetencji", który zostaje wydzielony

do podłoża. Do transformacji potrzebne jest bardzo małe stężenie dwuniciowego DNA, którego wielkość powinna przekraczać określone minimum, jest on również pocięty przez zewnątrzkomórkową nukleazę na fragmenty. Podczas pobierania transformującego DNA jedna z jego nici zostaje strawiona, a więc tylko pojedyncza, pozostała nić wchodzi do wnętrza komórki. Jeśli warunek wystarczającej homologii sekwencji jest spełniony, DNA zostaje włączony do genomu biorcy.

2) indukcja kompetencji przez specjalne, przedtransformacyjne zabiegi:

jest stosowana w przypadku komórek niezdolnych do naturalnej transformacji. Większość metod doświadczalnych polega na ściśle określonych zmianach warunków hodowli bakteryjnej. Tak

więc, E. coli może być transformowana po potraktowaniu chlorkiem wapnia komórek przechowywanych w niskiej temperaturze. Metoda ta ma bardzo duże znaczenie, choćby z uwagi

na powszechne zastosowanie E. coli w technikach klonowania molekularnego

3) protoplastyzacja komórek;

Transformację protoplastów stosuje się głównie w bakteriach gramdodatnich, np. z rodz. Bacillus, Streptomyces. Pozbawione ściany komórkowej protoplasty tych organizmów, po potraktowaniu

ich polietylenoglikolem, zdolne są do pobrania plazmidowego DNA. Przeciwnie, bezpośrednia fuzja protoplastów jest niezbędna do przekazania chromosomowego DNA. Prowadzi to do połączenia części genomów obu komórek rodzicielskich, a następnie może zostać odtworzona

komórka mutanta (rekombinanta) zdolna do życia. Rekombinanty mają cechy obu rodziców.

4) elektroporacja.

Metodę tę, wpływającą na przepuszczalność błon biologicznych i prowadzącą do ich fuzji pod wpływem pola elektrycznego, po raz pierwszy zastosowano do komórek eukariotycznych, na przykład do hybrydyzacji komórek roślinnych.

Transdukcja - przeniesienie DNA z komórki dawcy do biorcy przez bakteriofaga.
Możliwe np. u gatunki z rodzajów Salmonella, Escherichia, Shigella, Bacillus.

Zazwyczaj zostaje przeniesiony tylko mały fragment DNA gospodarza (tj. dawcy). Rozróżniamy dwa rodzaje transdukcji:

- niespecyficzną (ogólną), gdy każdy segment DNA gospodarza może zostać przeniesiony,
- specyficzną, ograniczoną do przekazania określonych segmentów DNA.

W transdukcji ogólnej fragment DNA gospodarza zostaje włączony do cząsteczki wirusa albo jako odcinek dodatkowy, albo zastępując genom fagowy. Podczas litycznego namnażania się faga w szczepie dawcy, fragmenty poszatkowanego DNA gospodarza mogą być przypadkowo włączone do główek fagowych w miejsce fagowego DNA. Lizaty fagowe składają się więc z mieszaniny fagów normalnych i defektywnych. Zakażenie biorcy przez normalną cząstkę fagową kończy się zazwyczaj jej lizą. Kilka komórek może jednak zostać zainfekowanych defektywnymi fagami transdukującymi, których DNA jest zdolny do rekombinacji z chromosomem biorcy. W wyniku wymiany homologicznych odcinków DNA następuje podstawienie uszkodzonego genu biorcy przez nienaruszony gen dawcy.

W transdukcji specyficznej tylko niektóre geny fagowe są zastąpione przez geny gospodarza. W obu przypadkach fagi transdukujące są zazwyczaj poronne, na przykład często tracą zdolność do lizy komórek gospodarza. Fag λ jest najlepiej znanym przykładem faga transdukcji specyficznej. Lambda zazwyczaj przenosi określone geny należące do operonów gal (wykorzystanie galaktozy) i bio (synteza biotyny). Przejście λ w stadium profaga wiąże się z integracją faga w określone miejsce chromosomu gospodarza, właśnie między genami gal a bio. W pewnych warunkach, np. po naświetleniu promieniami UV, czego wynikiem jest indukcja faga, zachodzi nieprecyzyjne wycięcie profaga z chromosomu. Fag może wówczas zostawić kawałek własnego DNA w chromosomie, włączyć natomiast fragment sąsiadującego DNA gospodarza, który może być następnie uwalniany z komórki wraz z DNA fagowym.

Po infekcji takim transdukującym fagiem komórki biorcy z uszkodzonym genem, np. gal , nienaruszony gen wprowadzony drogą transdukcji może zamienić uszkodzony gen gospodarza. Wszystkie powstałe tą drogą

rekombinanty są gal+. Podobnie są przekazywane geny przez faga j80 którego DNA włącza się w chromosom w pobliżu genów kodujących zdolność do biosyntezy tryptofanu. Fag j80 może więc przenosić geny trp.

Przeniesienie genów metodą specyficznej transdukcji (w przeciwieństwie do transdukcji ogólnej) przeważnie jest związane z włączaniem się faga do chromosomu.

Koniugacja - przekazywanie materiału genetycznego z komórki do komórki w drodze ich bezpośredniego kontaktu nazywamy koniugacją. Eksperyment wykonany w 1946 r. przez Lederberga i Tatuma: zastosowali oni dwa szczepy E. coli (podwójne auksotroficzne mutanty w dwóch różnych genach). Jeden z tych podwójnych mutantów był auksotrofem względem cechy A i B, ale mógł syntetyzować aminokwasy C i D (A~B~C + D + ). Drugi mutant uzupełniał pierwszego (A+B + C~D~). Żaden z mutantów nie mógł rosnąć, ani wytwarzać kolonii na podłożu minimalnym (bez aminokwasów), natomiast mieszanina dwóch mutantów miała zdolność do tworzenia kolonii na tym minimalnym podłożu. Komórki pochodzące z tych kolonii syntetyzowały wszystkie cztery aminokwasy, a więc genetycznie były typu A+B+C+D+ (tj. prototroficzne). Z powodu obecności mieszanej informacji genetycznej pochodzącej od dwóch zmutowanych typów rodzicielskich zostały nazwane rekombinantami. Użycie wielokrotnych mutantów jako partnerów koniugacyjnych wyklucza możliwość powstania rewertantów.

Przekazywanie DNA od dawcy do biorcy jest jednokierunkowe, zarówno rekombinacja, jak i segregacja zachodzi

w komórce biorcy. Badania procesu tworzenia się par koniugacyjnych udowodniły, że zdolność do pełnienia roli dawcy zależy od obecności ruchomej cząsteczki DNA, czynnika płciowego F w komórce. Czynnik F jest zamkniętą kolistą cząsteczką dwuniciowego DNA o wielkości 100 tys. p.z. i jako pozachromosomowy DNA zdolny do autonomicznej replikacji jest przykładem plazmidu. Zawiera on geny odpowiedzialne za proces koniugacji. Należą tu geny kodujące specjalne struktury na powierzchni komórki, takie jak pilusy F które są niezbędne do koniugacji. Włosowate pilusy, w liczbie dwóch lub trzech na komórkę, ułatwiają kontakt między komórkami dawcy i biorcy, prowadząc do powstania tzw. „krzyżowych agregatów" co umożliwia jednoczesny kontakt dawcy z kilkoma biorcami. DNA czynnika F penetruje komórkę biorcy po częściowym złączeniu się komórek krzyżujących się partnerów.

Tylko nieliczne bakterie w populacji F+ mogą przekazać chromosomowy DNA. Cechę tę mają komórki, w których nastąpiła integracja czynnika F do chromosomu. Liczba rekombinantów powstałych po koniugacji z tymi dawcami tysiąckrotnie przewyższa liczbę otrzymaną po koniugacji z komórkami F+ . Takie komórki nazywamy Hfr.

W integracji czynnika F istotną rolę pełnią elementy IS występujące zarówno na plazmidach, jak i w chromosomie E. coli. Umiejscowione na plazmidzie elementy IS2 i IS3 mogą się włączać we wszystkie miejsca chromosomu E. coli, gdzie znajduje się kopia odpowiedniego elementu IS. Integracja zachodzi według mechanizmu homologicznej rekombinacji i jest odwracalna. Inny mechanizm, niezależny od białka RecA, oparty na transpozycji elementów IS, jest również wykorzystywany do połączenia czynnika F z chromosomem. Po zmieszaniu Hfr z nadmiarem komórek F~ praktycznie każda komórka Hfr może znaleźć partnera i zaangażować się w koniugację. Przekazywaniu DNA towarzyszy jego replikacja rozpoczynająca się w miejscu insercji czynnika F, a koniec 5' nowo syntetyzowanej nici wchodzi jako pierwszy do komórki biorcy. Rekombinacja DNA dwóch partnerów w komórce biorcy (rekombinacja homologiczna) zachodzi natychmiast po przekazaniu DNA z komórki dawcy.

Im dalej od punktu początkowego znajduje się dany gen, tym później zostaje on przekazany i rzadziej wchodzi do biorcy w procesie nieprzerwanej koniugacji. Przekazywanie całego chromosomu E. coli trwa około 100 minut.

Szybkość przekazywania pozostaje niezmienna w ciągu całego procesu, a więc czas wejścia poszczególnych genów do komórki biorcy zależy od odległości między nimi. Technika ta nie pozwala jednak określić okresówmniejszych niż 1 minuta.

Wbudowanie się czynnika F w chromosom bakteryjny jest odwracalne. Czynnik F może zostać wycięty z chromosomu, co powoduje rewersję Hfr do F+. Częstość wycięcia jest zbliżona do częstości integracji, a proces przebiega, gdy miejsce wycięcia jest identyczne z miejscem wstawienia. W rzadkich przypadkach miejsca wycięcia i integracji nie pokrywają się, co prowadzi do przyłączenia fragmentu DNA gospodarza do uwolnionego czynnika F. Czynnik F z małym odcinkiem chromosomowego DNA to czynnik F'.

Koniugacyjne przekazywanie genów, po raz pierwszy opisane u E. coli, występuje powszechnie wśród

Enterobacteriaceae. Procesy koniugacyjne zachodzą i były intensywnie badane w Streptomyces coelicolor, w gatunkach rodzaju Nocardia i Rhizobium, jak również w innych bakteryjnych gatunkach i rodzajach.