Zagadnienia prof. P. Dobryszycki

1. Błony komórkowe.

Błona komórkowa – półprzepuszczalna błona biologiczna oddzielająca wnętrze komórki od świata zewnętrznego. Jest ona złożona z dwóch warstw fosfolipidów oraz białek, z których niektóre są luźno związane z powierzchnią błony (białka peryferyjne), a inne przebijają błonę lub są w niej mocno osadzone białkowym lub niebiałkowym motywem (białka błonowe).

Zazwyczaj inne białka występują po wewnętrznej, a inne po zewnętrznej stronie błony. Cząsteczki należące do błony mogą z łatwością poruszać się wewnątrz swojej warstwy (dyfuzja lateralna, o ile nie są związane na przykład od wewnątrz z białkami cytoszkieletu), jednak napotykają duże trudności z przejściem do warstwy przeciwnej.

U wszystkich organizmów poza Archaea, fosfolipidy wchodzące w skład błony komórkowej składają się głównie z D-glicerolu połączonego wiązaniem estrowym z nierozgałęzionymi kwasami tłuszczowymi, które nie reagują między sobą. Organizmy żyjące w wysokich temperaturach mają też dużo cholesteroli w błonach komórkowych.

Fosfolipidy błon komórkowych Archaea składają się z L-glicerolu połączonego wiązaniem eterowym z łańcuchami powstałymi z izoprenu. Łańcuchy te mogą być rozgałęzione, mogą łączyć się ze sobą, mogą nawet łączyć się z fosfolipidami z przeciwnej warstwy błony. Te połączenia stabilizują błonę i umożliwiają niektórym Archaea życie w ekstremalnie wysokich temperaturach.

Błony muszą dla swojego właściwego funkcjonowania zachować półpłynną konsystencję. Zarówno znaczne obniżenie jak i znaczne podwyższenie temperatury zmienia właściwości błony w stopniu, który może być dla komórki śmiertelny. Dlatego organizmy żyjące w różnych temperaturach mają różny skład błon komórkowych.

Błony biologiczne uczestniczą w:

• biernym lub czynnym, selektywnym transporcie jonów i substancji niejonowych,

• wydzielaniu produktów komórki do środowiska (egzocytoza) oraz pobieraniu makrocząsteczek do komórki (endocytoza),

• reakcjach na sygnały pochodzące ze środowiska (transdukcja sygnałów) poprzez receptory błonowe,

• przenoszeniu sygnałów do innych okolic komórki lub przekazywaniu ich do innych komórek,

• oddziaływaniu między komórką i podłożem oraz między komórkami.

Ich rolą jest też:

• oddzielenie wnętrza komórki od środowiska,

• oddzielanie w komórkach kompartymentów (przedziałów) o różnej koncentracji różnych substancji (enzymów, jonów, substratów),

• pośredniczenie w transporcie biernym i czynnym,

• wytwarzanie potencjału elektrochemicznego - różnej koncentracji jonów,

• miejsce przebiegu procesów (np. łańcuch transportu elektronów w mitochondriach i chloroplastach)

1. Fotosynteza.

Fotosynteza – biochemiczny proces wytwarzania związków organicznych z materii nieorganicznej, przez komórki zawierające chlorofil lub bakteriochlorofil, przy udziale światła. Proces ten utrzymuje wysoki poziom tlenu w atmosferze oraz przyczynia się do wzrostu ilości węgla organicznego w puli węgla, zwiększając masę materii organicznej kosztem materii nieorganicznej.

Fotosynteza zachodzi w dwóch etapach – faza jasna (określana jako faza przemiany energii), w której światło jest absorbowane, a jego energia jest zamieniana na energię wiązań chemicznych, a jako produkt uboczny wydzielany jest tlen, oraz faza ciemna (określana jako faza przemiany substancji), w której energia wiązań chemicznych, związków powstałych w fazie świetlnej, jest wykorzystywana do syntezy związków organicznych. Obie fazy zachodzą jednocześnie i na świetle. Wydajność zamiany energii światła na energię wiązań chemicznych węglowodanów wynosi 22–33%. W uproszczonej formie sumaryczny przebieg fotosyntezy z glukozą jako syntezowanym węglowodanem zapisuje się:

6H₂O + 6CO₂ + (energia świetlna) → C₆H₁₂O₆ + 6O₂; ΔE –2872 kJ/mol (–687 kcal/mol)

Najczęściej substratami fotosyntezy są dwutlenek węgla i woda, produktem – węglowodan i tlen (jako produkt uboczny), a źródłem światła – słońce. Zarówno bezpośrednie produkty fotosyntezy, jak i niektóre ich pochodne (np. skrobia i sacharoza) określane są jako asymilaty.

W komórkach eukariotycznych proces fotosyntezy zachodzi w wyspecjalizowanych organellach – chloroplastach, zawierających barwniki fotosyntetyczne. U roślin organami zawierającymi komórki z chloroplastami są głównie liście, będące podstawowymi organami asymilacyjnymi. Pewne ilości chloroplastów zawierają także komórki niezdrewniałych łodyg oraz kwiatów i owoców. Ze względu na rozkład wody i wydzielanie tlenu sinice i fotosyntetyzujące eukarionty zalicza się do organizmów o oksygenicznym typie fotosyntezy, z wydzieleniem tlenu. Wśród bakterii jedynie sinice przeprowadzają fotosyntezę w sposób opisany powyżej. Pozostałe jako donorów elektronów używają związków siarki lub prostych związków organicznych. Tlen w takim przypadku nie jest wydzielany, a proces określa się jako anoksygeniczny typ fotosyntezy.

Na proces fotosyntezy składają się dwa etapy:

• faza jasna lub inaczej faza świetlna zachodząca w błonach tylakoidów, polegająca na przekształceniu energii zawartej w świetle do energii wiązań chemicznych dwóch związków chemicznych: ATP i NADPH. Oba związki przenoszące energię wytwarzane są dzięki przenoszeniu elektronów poprzez kolejne przenośniki. Kwanty światła pochłonięte przez cząsteczki barwników asymilacyjnych służą do oderwania elektronów od cząsteczek chlorofilu, a przyłączonych do kompleksów białkowych znajdujących się w błonach tylakoidów. Energia światła wykorzystywana jest do oderwania elektronów od cząsteczki wody i przeniesienia ich przez system przekaźników elektronów na utlenioną formę NADP⁺. W transporcie elektronów biorą udział kompleksy barwnikowo-lipidowo-białkowe: fotoukład I (PS I), fotoukład II (PS II), kompleks cytochromowy b₆f trwale związane z błonami, oraz ruchliwe przekaźniki elektronów w postaci plastochinonu i plastocyjaniny. Transport elektronów przez wymienione przenośniki prowadzi także do wytworzenia różnicy stężeń jonów wodorowych w poprzek błon. Energia zmagazynowana w tej postaci jest wykorzystywana przez enzym, syntazę ATP, do wytworzenia ATP. Uproszczony zapis reakcji zachodzących w fazie jasnej przedstawia równanie (nie przedstawia ono jednak ściśle proporcji NADPH do ATP):

2 H₂O + 2 NADP⁺ + 3 ADP + 3 Pi → 2 NADPH + 2 H⁺ + 3 ATP + O₂

• faza ciemna nazywana także cyklem Calvina-Bensona zachodząca w stromie chloroplastów. Energia zgromadzona w ATP i NADPH+H⁺ wykorzystywana jest do przekształcenia dwutlenku węgla do prostych związków organicznych. Następuje to poprzez przyłączenie CO₂ do pięciowęglowego związku – 1,5-bisfosforybulozy. Powstały związek sześciowęglowy rozpada się na dwie cząsteczki zawierające po trzy atomy węgla, które po zredukowaniu przy użyciu NADPH+H⁺ stanowią pierwszy trwały produkt fotosyntezy – aldehyd 3-fosfoglicerynowy (triozę). W wyniku ich przekształcania powstaje glukoza oraz odtwarzana jest 1,5-bisfosforybuloza konieczna do związania kolejnych cząsteczek dwutlenku węgla.

Uproszczony zapis reakcji zachodzących w fazie ciemnej przedstawia równanie:

3 CO₂ + 9 ATP + 6 NADPH + 6 H⁺ → C₃H₆O₃ + 9 ADP + 8 Pi + 6 NADP⁺ + 3 H₂O

RuBisCO, karboksylaza/oksygenaza rybulozo-1,5-bisfosforanu – enzym występujący w komórkach roślin. Jest to niezwykle rozpowszechniony enzym katalizujący reakcję przyłączenia cząsteczki dwutlenku węgla do rybulozo-1,5-bisfosforanu (RuBP) w tak zwanej fazie ciemnej procesu fotosyntezy. In vivo enzym jest aktywny w obecności światła. Działanie enzymu związane jest też z fotooddychaniem gdzie RuBisCO funkcjonuje jako oksygenaza, katalizująca rozbicie cząsteczki r-1,5-bisfosforanu z udziałem tlenu cząsteczkowego na fosfoglicerynian i fosfoglikolan. RuBisCO jest białkiem, które stanowi ok. 50% wszystkich rozpuszczalnych białek występujących w liściach roślin.

1. Regulacja metabolizmu.

Ponieważ środowisko większości organizmów podlega nieustannym zmianom, reakcje metaboliczne muszą być dokładnie regulowane dla utrzymania w komórce stanu stałości warunków zwanego homeostazą. Regulacja metaboliczna pozwala również organizmom na odpowiadanie na bodźce zewnętrzne oraz warunkuje interakcję ze środowiskiem. Dla zrozumienia mechanizmów regulacji szlaków metabolicznych niezbędne są definicje dwóch kluczowych pojęć. Po pierwsze, "regulacja" szlaku przez enzym to sposób, w jaki tempo jego przebiegu wzrasta lub spada w odpowiedzi na bodźce. Po drugie, "kontrola" sprawowana przez enzym to efekt, jaki zmiany te wywierają na ogólny przebieg szlaku. Dla przykładu, enzym wykazujący zdolność znacznej modyfikacji aktywności nie będzie uwzględniony jako enzym kontrolujący dany szlak, jeśli ta modyfikacja aktywności wywierać będzie niewielki wpływ na ciąg procesów w tym szlaku.

Regulacja metabolizmu zachodzi na wiele sposobów. Podstawowa regulacja szlaku metabolicznego jest polega na automatycznej odpowiedzi na zmianę stężenia substratów; przykładowo, zmniejszenie ilości produktów może – dla równowagi – przyspieszyć przebieg reakcji. Często w ten sposób zachodzi regulacja allosteryczna aktywności poszczególnych enzymów szlaku. Regulacja zewnętrzna wywołuje zmiany w metabolizmie komórki za pomocą sygnałów pochodzących z innych komórek; sygnały te mają zwykle postać rozpuszczalnych w wodzie substancji, takich jak hormony i czynniki wzrostu i są odbierane przez określone receptory na powierzchni komórki. Są one następnie przekazywane do wnętrza komórki przez wewnętrzny łańcuch przekazywania sygnału, m.in. za pośrednictwem fosforylacji białek.

Przykładem bardzo dobrze poznanego mechanizmu regulacji zewnętrznej jest wpływ insuliny na metabolizm glukozy. Insulina jest hormonem produkowanym w odpowiedzi na podwyższenie poziomu glukozy w organizmie. Łączenie się hormonu z receptorem insulinowym aktywuje grupę kinaz białkowych, które pobudzają komórki do pobierania glukozy z krwi i przekształcania jej w substancje zapasowe (na przykład kwasy tłuszczowe i glikogen. Metabolizm glikogenu jest z kolei kontrolowany przez fosforylazę, enzym rozbijający glikogen, oraz tworzącą go syntazę glikogenu. Enzymy te są regulowane w sposób obustronny – fosforylacja dezaktywują syntazę glikogenu, aktywując jednocześnie fosforylazę. Insulina wywołuje syntezę glikogenu poprzez aktywację fosfatazy białkowej i hamowanie fosforylacji wymienionych enzymów.

1. Oczyszczanie białek.

Celem oczyszczania białka jest wyizolowanie określonego białka z mieszaniny białek zawartej w materiale wyjściowym. Stosuje się tu kombinację technik frakcjonowania, która wykorzystuje rozpuszczalność, masę cząsteczkową, ładunek lub/i specyficzne dla danego białka powinowactwo wiązania.

Homogenizacja – stosuje się ją w celu otrzymania roztworu białka z tkanek i komórek, w tym celu można również zastosować lizę osmotyczną. Następnie roztwór poddaje się wirowaniu różnicowemu w celu wyizolowania frakcji subkomórkowej zawierającej dane białko.

Solubilizacja – stosowana w przypadku białek związanych z błoną komórkową, w celu ich uwolnienia stosuje się detergent

Aby uniknąć inaktywacji lub denaturacji białka należy kontrolować pH wykorzystywanych roztworów, procedury prowadzić w niskiej temperaturze oraz stosować inhibitory proteaz.

Precypitacja siarczanem amonu – rozpuszczalność białek maleje wraz ze zwiększeniem stężenia siarczanu amonu w roztworze. Stężenie siarczanu amonu, w którego obecności białko się wytrąca z roztworu i ulega precypitacji, może na tyle różnicować dane białko od innych białek znajdujących się w mieszaninie, że umożliwi jego skuteczne oddzielenie.

Dializa – białka można oddzielić od mniejszych cząsteczek (o niewielkiej masie) na drodze dializy z zastosowaniem półprzepuszczalnej błony, która umożliwia przejście małych cząsteczek, ale nie białek.

Chromatografia żelowa – zwana również filtracją żelową stosowana jest do rozdziału białek różniących się masą cząsteczkową. Kolumnę chromatograficzną wypełnia się złożem w postaci ziarenek o średnicy około o zdefiniowanej wielkości porów zbudowanych z nierozpuszczalnego polimeru (typu: dekstran, agaroza) lub poliakrylamidu. Po nałożeniu na żel mieszaniny, białka o małych rozmiarach wnikają do wnętrza ziaren duże natomiast nie mogą. Droga do momentu wycieku z kolumny, którą musi pokonać każdy ze składników próbki jest więc nierówna. Cząsteczki o najmniejszym ciężarze cząsteczkowym mają do pokonania najdłuższą drogę i dlatego wypływają najpóźniej z kolumny. Białka o dużej masie cząsteczkowej i o efektywnej średnicy większej niż pory ziaren złoża mają do pokonania krótszą drogę w żelu i wędrują najszybciej. Pojawiają się zatem jako pierwsze u wylotu kolumny.

Chromatografia jonowymienna - rodzaj chromatografii cieczowej, metoda rozdziału mieszaniny cząsteczek, w której podłożem (fazą stacjonarną, nieruchomą) umieszczonym w kolumnie są żywice syntetyczne, celuloza i żele dekstranowe, do nich zostały przyłączone grupy dysocjujące, odwracalnie wiążące kationy lub aniony; fazą ruchomą może być np. kwas fosforowy lub kwaśny fosforan sodu oraz chlorek sodu o wzrastającym gradiencie (zwiększającym się stężeniu) i odpowiednim pH.

Chromatografia powinowactwa – metoda izolacji i oczyszczania białek oraz kwasów nukleinowych polegająca na specyficznym i wykazującym duże powinowactwo wiązaniu się białka lub kwasu nukleinowego z odpowiednim ligandem (np. inhibitor enzymu, łańcuch poliU); ligand unieruchamia się na nierozpuszczalnym nośniku i upakowuje w kolumnie; po nałożeniu mieszaniny białek tylko określone białko wiąże się z ligandem, a wszystkie pozostałe wypływają z kolumny; związane białko jest następnie uwalniane z liganda w wysoce oczyszczonej formie.

PAGE – elektroforeza w żelu poliakrylamidowym wykorzystuje zjawisko poruszania się cząsteczek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym w kierunku jednej z elektrod. W PAGE rozdział następuje zarówno pod wpływem masy cząsteczkowej jak i ładunku.

SDS-PAGE - najpowszechniej stosowaną techniką elektroforetycznego rozdziału białek w żelach poliakrylamidowych jest elektroforeza w obecności SDS, tzw. SDS-PAGE. SDS (siarczan dodecylu sodu) jest silnym detergentem anionowym, który niszczy struktury białkowe wyższego rzędu, denaturując białka do postaci liniowej (struktura pierwszorzędowa) oraz nadaje im wypadkowy ładunek ujemny. Przyjmuje się, że statystycznie jeden anion dodecylosiarczanowy przypada na dwie reszty aminokwasowe. Ponadto do rozdzielanych próbek dodaje się silne środki redukujące, takie jak 2-merkaptoetanol lub DTT, które redukują mostki disiarczkowe obecne w białkach. Można więc przyjąć, że tempo migracji białek podczas elektroforezy SDS-PAGE jest zależne tylko od ich masy i jest wprost proporcjonalne do jej logarytmu. Dlatego też możliwe jest stosowanie tzw. standardów wielkości białek.

Ogniskowanie izoelektryczne – szczególny przypadek elektroforezy białek natywnych, w którym białka są rozdzielane ze względu na ich punkt izoelektryczny (pI). Nośnikiem najczęściej jest żel poliakrylamidowy, a rozdział odbywa się w gradiencie pH. Naładowane białko wędruje w kierunku odpowiedniej elektrody (białka naładowane ujemnie ku anodzie, a dodatnio ku katodzie). W momencie, kiedy białko znajdzie się w obszarze o pH odpowiadającym jego pI, jego ładunek wynosi 0. Nie jest więc już jonem i nie porusza się w polu elektrycznym.

1. Organizacja struktur białek

Strukturę powstałego białka można opisać na czterech poziomach. Pierwszy z nich, nazywany strukturą pierwszorzędową, odnosi się do kolejności aminokwasów w łańcuchu peptydowym. Jest ona uwarunkowana przez sekwencję nukleotydową konkretnych genów. Już na tym poziomie pojawiają się pewne przesłanki do możliwych ilości konformacji przestrzennych białek. Związane jest to z kątami torsyjnymi ϕ i ψ, czyli miarą rotacji wokół wiązania między grupą aminową i węglem α (kąt ϕ) oraz wiązania między węglem α i grupą karbonylową (kąt ψ) dwóch sąsiadujących ze sobą jednostek peptydowych. Wyznaczają one sposób ułożenia łańcucha polipeptydowego. Kąty te mogą przybierać jedynie pewne ograniczone wartości przedstawione na diagramie Ramachandrana.

Kolejnym poziomem organizacji struktury białka jest struktura drugorzędowa uwarunkowana przez powstawanie powtarzających się lokalnych struktur łańcucha polipeptydowego określanych jako helisy α, harmonijki i zwroty β oraz pętle omega (Ω). Ich generowanie związane jest z powstawaniem regularnych wiązań wodorowych między grupami peptydowymi N–H i C=O aminokwasów, które znajdują się blisko siebie w liniowej sekwencji.

Struktura trzeciorzędowa opisuje sposób przestrzennego ułożenia całego łańcucha polipeptydowego. Jest to proces silnie związany z występowaniem hydrofobowych łańcuchów bocznych wewnątrz cząsteczki, a naładowanych łańcuchów polarnych na jej powierzchni. Taki układ jest bardziej stabilny termodynamicznie. W formowaniu struktury trzeciorzędowej biorą również udział siły van der Wallsa, które dzięki dążeniu białka do ciasnego upakowania węglowodorowych łańcuchów bocznych są maksymalizowane. Czasami funkcja białek wymaga istnienia dwóch lub więcej ściśle upakowanych rejonów. Są one wtedy połączone elastycznymi odcinkami łańcucha umożliwiającymi prawidłowe działanie peptydu.

Ostatnim poziomem struktury przestrzennej białka, jest struktury czwartorzędowa. Jest ona związana z wzajemnym łączeniem się podjednostek białkowych (łańcuchów polipeptydowych) i ich oddziaływaniem ze sobą. Często współdziałają ze sobą róże typy
i ilości podjednostek, dlatego dopiero po odpowiednim ich połączeniu peptyd uzyskuje pełną funkcjonalność.

1. Metale w reakcjach enzymatycznych

Metale występują w metaloenzymach, enzymach należących do metaloprotein o specyficznych funkcjach katalitycznych. W ich katalitycznych centrach aktywnych znajdują się jonym metalu np. miedzi, cynku lub molibdenu, które koordynowane są przez ligandy lub grupy boczne aminokwasów. Najczęstszymi ligandami są: grupa tiolowa cysteiny, imidazolowa histydyny, grupy karboksylowe kwasów glutaminowego i asparaginowego oraz grupa fenolowa tyrozyny.

• Miedź (Cu) występuje w kilkunastu poznanych metaloenzymach. Najlepiej zbadane to: dysmutaza ponadtlenkowa (niezbędna do dekompozycji wolnych rodników), oksydaza cytochromowa, hydroksylaza dopaminy (niezbędna do syntezy noradrenaliny), urykaza, oksydaza lizylowa (niezbędna do tworzenia wiązań krzyżowych w kolagenie i elastynie), dioksygenaza tryptofanowa, tyrozynaza (synteza melaniny), oksydaza tiolowa (utrzymanie struktury keratyny), lecytynaza, katalaza i inne oksydazy mono- i dwuaminowe.

• Molibden (Mo) jest składnikiem co najmniej trzech enzymów: aldehydooksydazy, ksantynooksydazy i oksydazy tiolowej.

• Cynk (Zn) jest składnikiem kilkudziesięciu enzymów, w tym np. dehydrogenazy alkoholowej.

• centra żelazo-siarkowe – najprostsze z nich zawiera jeden jon żelaza połączony z czterema resztami cysteiny, występuje np. w oksydoreduktazach.

Mechanizmy uczestniczenia metali w reakcjach enzymatycznych:

• Metal uczestniczy jako jeden ze składników centrum katalitycznego.

• Atomy metali wytwarzają lub stabilizują taką konformację przestrzenną cząsteczki białkowej, która jest niezbędna dla przebiegu reakcji katalitycznej lub dla utworzenia katalitycznego centrum.

• Metale aktywują niektóre enzymy tworząc kompleks metal- substrat, który dopiero wówczas jest atakowany przez enzym. Atom metalu jest swego rodzaju mostkiem wiążącym aktywne centrum enzymu z substratem. Metal uczestniczy przy przyłączeniu koenzymu    (organicznej grupy prostetycznej ) do apoenzymu.

1. Miareczkowanie aminokwasów

Aminokwasy mają charakter amfoterycznych. Posiadają grupy aminowe zdolne do włączania

protonu oraz grupy karboksylowe zdolne do oddysocjowania protonu. Dodatkowe łańcuchy

boczne mogą ulegaj różniej jonizacji. W roztworze cały czas panuje równowaga pomiędzy

wszystkimi formami jonowymi. W zależności od pH jednych form jonowych jest więcej, nich mniej. Krzywa miareczkowania jest to zależność zmiany pH od ilości dodawanego kwasu lub zasady. Wartość pH nie zmienia się jednostajnie. Dla wartości pH zbliżonych do pK zmiany pH są małe. Mechanizm ten zwany buforowaniem polega na przesuwaniu równowagi przeciwnie do zmian pH. Gdy dodawany jest kwas równowaga jest przesuwana w stronę formy niezdysocjowanej tak, aby związać nadmiar jonów wodorowych. Dla wartości pH zbliżonych do pI zmiany pH są duże.

1. Hamowanie enzymów

Hamowanie czyli inaczej inhibicja może być procesem nieodwracalnym lub odwracalnym. Przy hamowaniu nieodwracalnym inhibitor łączy się z enzymem tworząc kompleks enzym - inhibitor, przez co enzym traci swoją aktywność. Hamowanie odwracalne polega na tym, że inhibitor o strukturze przestrzennej zbliżonej do struktury substratu wiąże się w centrum aktywnym enzymu uniemożliwiając wiązanie substratu lub inhibitor wpływa na centrum aktywne w ten sposób że substrat jest wiązany ale dalsza reakcja zostaje zahamowana (inhibitory allosteryczne).

Enzym możemy również zatrzymać powodując jego denaturację, np. termiczną (wysoka temperatura), wiążąc jego kofaktor (np. jony Mg2+ wymagane do aktywności enzymów restrykcyjnych przez EDTA), ekstrakcja fenol/chloroform lub strącenie etanolem, trafieni na drodze proteolityczne przez proteazy

1. Projektowanie leków

Dwa modele projektowania leków:

• ZWIĄZEKEFEKT FIZJOLOGICZNYCZĄSTECZKA DOCELOWA

• CZĄSTECZKA DOCELOWAZWIĄZEKEFEKT FIZJOLOGICZNY

Wybór jednostki chorobowej

• Określenie miejsca działania (receptor, enzym, kwas nukleinowy)

• Określenie testu biologicznego

• Znalezienie struktury wiodącej

• Określenie zależności między budową a działaniem biologicznym (SAR)

• Zidentyfikowanie grupy farmakoforowej (Farmakofor jest modelem opisującym relacje przestrzenne między elementami wspólnymi dla ligandów oddziałujących z danym receptorem. Tworzenie farmakoforu jest kluczowym etapem projektowania leków w przypadku, gdy znana jest struktura co najmniej kilku aktywnych ligandów, a brakuje danych dotyczących budowy receptora)

• Poprawienie oddziaływania między strukturą a miejscem działania

• Poprawienie właściwości farmakokinetycznych

• Patentowanie

• Badanie metabolizmu

• Badanie toksyczności

• Opracowywanie procesu technologicznego

• Badania kliniczne

• Wprowadzenie leku do obrotu

Identyfikacja targetu (miejsca docelowego)

• “Które białko jest odpowiednie/odpowiedzialne?”

Weryfikacja targetu

• “Czy wybrany target jest „podatny na lek”?”

Identyfikacja związku czynnego (lead)

• “Jaki związek będzie dobrze oddziaływał z targetem?”

Optymalizacja związku czynnego

• “Który ze związków ma najlepsze własności farmakokinetyczne i nie jest toksyczny?”

Wybór targetu?

• Zwykle jest to białko (DNA – czasami w terapiach nowotworowych)

• Znajomość mechanizmu działania

• Specficzność(!)

• Żadnych podobnych

• “Podatność na lek” (Posiadanie miejsca aktywnego, które może być zajęte prze małą cząsteczkę)

• Istnieje już podobny target?

Stosowanym powszechnie kryterium, pozwalającym z dużym prawdopodobieństwem odrzucić nieefektywne molekuły jest zbiór reguł Lipińskiego (Lipinski rules). Oparty jest on na analizie statystycznej właściwości istniejących leków i głosi, że cząsteczka chemiczna ma niewielkie szanse aby być lekiem, jeśli spełnia co najmniej dwa spośród poniższych kryteriów:

• ma masę > 500Da

• ma CLOGP (obliczoną wartość logP) > 5

• zawiera więcej niż 5 miejsc donorowych dla wiązań wodorowych

• zawiera więcej niż 10 miejsc akceptorowych dla wiązań wodorowych

Współczynnik podziału logP

jest zdefiniowany jako logarytm stosunku stężeń równowagowych danej substancji w wodzie i oktanolu:

Jest on miarą hydrofobowości molekuły i koreluje z jej zdolnością do przenikania przez błony biologiczne. Ma duże znaczenie np. w przypadku leków działających na ośrodkowy układ nerwowy, dla których istotnym parametrem jest zdolność do przechodzenia przez barierę krew-mózg.

Chociaż jest on zdefiniowany w oparciu o dane doświadczalne programy do analizy QSAR z reguły zawierają algorytmy pozwalające oszacować jego wartości na podstawie budowy chemicznej danego związku. Parametr logP uzyskany w wyniku takich obliczeń nosi nazwę CLOGP.

1. Receptory 7TM

Receptory sprzężone z białkami G, receptory GPCR (GPCR z ang. G Protein-Coupled Receptor) – receptory metabotropowe (receptory siedmiotransbłonowe, 7TM, transmembranowe), które pośredniczą w przekazie rozmaitych sygnałów do wnętrza komórki.

Receptory GPCR są zbudowane z pojedynczego polipeptydu (łańcucha aminokwasowego) o strukturze α-helikalnej. Cząsteczki receptora są silnie sfałdowane i zanurzone w błonie komórkowej. Łańcuch polipeptydowy przechodzi przez błonę lipidową komórki siedmiokrotnie, tworząc hydrofobową domenę transmembranową (7TM), stąd nazwa "siedmiohelikalne transmembranowe receptory komórkowe". Koniec karboksylowy (-COOH) polipeptydu znajduje się zawsze wewnątrz, a koniec aminowy (-NH2) zawsze na zewnątrz komórki.

Główną funkcją GPCR jest przyłączenie liganda oraz sprzężenie z białkiem G.

1. Aktywność enzymatyczna

Jak wszystkie katalizatory, enzymy obniżają energię aktywacji (E_a lub ΔG^‡) reakcji chemicznej, przyspieszając w ten sposób przebieg reakcji (patrz: Struktury i mechanizmy działania). Większość reakcji enzymatycznych (tj. z udziałem enzymów) przebiega miliony razy szybciej niż ich niekatalizowane enzymatycznie odpowiedniki. Jednym z najszybciej działających znanych enzymów jest anhydraza węglanowa. Jedna cząsteczka tego enzymu potrafi w sprzyjających warunkach w jedną sekundę uwodnić od 10⁴ do 10⁶ cząsteczek dwutlenku węgla. Z kolei jedna cząsteczka jednego z najwolniejszych enzymów – lizozymu, katalizuje 1 akt elementarny co 2 sekundy. Jak wszystkie katalizatory, również enzymy nie zużywają się w trakcie przebiegu reakcji, a także nie wpływają na ich równowagę. Enzymy różnią się od zwykłych katalizatorów, przejawiając znacznie większą specyficzność substratową. Aktywność enzymatyczna może być zatrzymana lub obniżona przez inne cząsteczki – inhibitory. Wiele leków i trucizn jest inhibitorami enzymów. Z kolei aktywatory enzymatyczne to cząsteczki zwiększające aktywność enzymów. Ponadto aktywność enzymów zależy od parametrów fizykochemicznych środowiska reakcji, takich jak: temperatura, pH, siła jonowa, obecność niektórych jonów i innych.

Enzymy mogą na kilka różnych sposobów zmniejszać swobodną energię aktywacji Gibbsa (ΔG‡):

• Obniżanie energii aktywacji przez tworzenie środowiska, w którym następuje stabilizacja stanu przejściowego (np. zniekształcenie cząsteczki substratu – dzieje się to przez utrwalenie konformacji stanu przejściowego pomiędzy substratem, a produktem oraz zniekształcenie przez enzym wiązań w cząsteczce substratu, dzięki czemu zmniejsza się suma energii wymaganej do zakończenia przejścia).

• Obniżanie energii stanu przejściowego przez likwidację niekorzystnych energetycznie oddziaływań ze środowiskiem, i ich zamianę na korzystne energetycznie oddziaływania z centrum aktywnym (np. oddziaływania elektrostatyczne ładunków o przeciwnych znakach).

• Wykorzystanie alternatywnego szlaku przejścia, np. tymczasowa reakcja substratu do pośredniego kompleksu enzym-substrat (ES), która nie byłaby możliwa w nieobecności enzymu.

• Zmniejszanie entropii reakcji poprzez usytuowanie dostarczanych razem substratów w poprawnej orientacji, niezbędnej do zajścia reakcji. Rozpatrując energetykę reakcji enzymatycznej pod kątem jedynie zmiany entalpii (ΔH‡), efekt ten jest zwykle pomijany. Wiąże się to z faktem, że ma on miejsce tylko dla stanu podstawowego reakcji (substraty), a jego wpływ na właściwą katalizę jest znikomo mały.

Stabilizacja stanu przejściowego

Enzymy w obsługiwanych reakcjach obniżają energię aktywacji (ΔG‡) poprzez stabilizację stanu przejściowego. Jest to możliwe poprzez niezwykle efektywne wykorzystanie efektów oddziaływań elektrostatycznych pomiędzy cząsteczkami w stanie przejściowym, a otaczającym je środowiskiem. W reakcji niekatalizowanej kompleks stanu przejściowego (S*) oddziałuje z otaczającą wodą w sposób mało uporządkowany, co zmusza system do pokonania dużej bariery energetycznej (energia aktywacji). Enzym, zapewniając ściśle dopasowaną „kieszeń” centrum aktywnego, jest w stanie zagwarantować optymalne energetycznie oddziaływanie kompleksu stanu przejściowego (ES*) z otaczającym je środowiskiem – na przykład zapewniając mu kontakt z resztami aminokwasowymi centrum aktywnego dokładnie pasującymi elektrostatycznie do rozkładu ładunków na powierzchni kompleksu stanu przejściowego. Dodatkowo, samo zbliżenie do siebie substratów, a także zapewnienie odpowiednich donorów/akceptorów elektronów zachodzącej reakcji, obniża koszty energetyczne jej przebiegu, co nie ma miejsca dla reakcji zachodzącej spontanicznie w wodzie.

1. Widmo absorpcyjne

Widmo absorpcyjne – widmo, które powstaje podczas przechodzenia promieniowania elektromagnetycznego przez chłonny ośrodek absorbujący promieniowanie o określonych długościach. Można zarejestrować przy użyciu metod spektroskopii. Graficznie ma postać widma ciągłego z ciemnymi liniami (dla gazowych pierwiastków). Występowanie widma absorpcyjnego jest spowodowane pochłanianiem przez substancję fotonów tylko o określonych długościach fali – takich, które mogą spowodować wzbudzenie atomu lub cząsteczki do stanu dopuszczanego przez prawa mechaniki kwantowej. Zmiany stanu wzbudzenia dotyczą zarówno elektronów jak i oscylacji i rotacji całych cząstek.

Obrazem widma absorpcyjnego związku chemicznego są pasma o strukturze liniowej lub ciągłej z silniej lub słabiej zaznaczonymi ekstremami.

1. Mechanizm wiązania tlenu i dwutlenku węgla w hemoglobinie

Przyłączenie cząstki tlenu do jednej z czterech cząstek hemu hemoglobiny powoduje zmianę struktury drugo-, trzecio- i czwartorzędowej całego tetrameru. Przyczyną jest wsunięcie atomu żelaza (położonego w przypadku nieutlenowanej hemoglobiny w odległości około 0,06 nm od płaszczyzny hemu) w płaszczyznę pierścienia hemu po połączeniu z tlenem.

Wsunięcie atomu żelaza pociąga związaną z nim tzw. histydynę proksymalną leżącą w pozycji F8, co powoduje przemieszczenie sąsiednich aminokwasów globiny. Doprowadza to w rezultacie do pęknięcia wiązań poprzecznych pomiędzy końcami karboksylowymi wszystkich czterech cząstek globiny. W efekcie dochodzi do rotacji pary α1/β1 względem pary α2/β2 o 15°

Konformacja, w której hemoglobina jest tylko częściowo utlenowana, określana jest jako stan T (od ang. taut – naprężony), zaś konformacja całkowicie utlenowanej hemoglobiny po wykonaniu obrotu o 15° – jako stan R (ang. relaxed – rozluźniony).

Hemoglobina w stanie R wykazuje większe powinowactwo do tlenu aniżeli w stanie T. W związku z tym każde przyłączenie w płucach cząstki tlenu do hemoglobiny ułatwia przyłączanie następnych (tzw. wiązanie kooperacyjne), zaś odczepienie każdej cząstki tlenu w tkankach ułatwia uwalnianie kolejnych cząstek O2. Wiązanie kooperacyjne sprzyja maksymalizacji wysycania tlenem hemoglobiny w płucach (przy danym ciśnieniu parcjalnym tlenu – PO2) oraz oddawania przez nią tlenu w tkankach.

Hemoglobina transportuje około 15% z ogólnej ilości CO2 przenoszonego przez krew. W momencie gdy z cząstki hemoglobiny zostaje uwolniony tlen, dwutlenek węgla wchodzi w reakcję z grupą α-aminową globiny, tworząc karbaminian, jednocześnie w wyniku tej reakcji powstają wolne protony równoważące protony zużywane w płucach przez efekt Bohra (dwa mole protonów na każdy mol CO2). W wyniku powstania karbaminianu zmienia się ładunek grup na końcach łańcuchów globiny, co umożliwia tworzenie wiązań poprzecznych i przejście do stanu T.

W płucach natomiast, w momencie gdy dochodzi do przejścia ze stanu T do stanu R, w wyniku rozerwania wiązań poprzecznych uwolnione zostają protony z atomów azotu pierścieni imidazolowych histydyny znajdującej się w pozycji HC3 (His 146) na łańcuchach β. Łączą się one z wodorowęglanami, co prowadzi do powstania kwasu węglowego, rozkładanego następnie przez anhydrazę węglanową zawartą w erytrocytach na wodę i dwutlenek węgla usuwany z krążenia.

W tkankach występuje niższe pH niż w płucach, w związku z czym protony wiążą się z histydyną HC3, sprzyjając przejściu hemoglobiny ze stanu R do stanu T.

1. Tłuszcze i ich metabolizm

Tłuszcze – zwyczajowa nazwa grupy lipidów, estrów glicerolu i kwasów tłuszczowych, głównie triacylogliceroli. Reszty kwasowe występujące w cząsteczkach tłuszczów zawierają zwykle od 12 do 18 atomów węgla.

Katabolizm tłuszczy

Beta-oksydacja. W komórkach (mitochondria) kwasy tłuszczowe ulegają aktywacji do tioestrów przy udziale ATP. Dzięki temu stają się związkami reaktywnymi i wysokoenergetycznymi.

Dehydrogenaza przy udziale FAD (FAD FADH2) powoduje odwodorowanie kwasów tłuszczowych w pozycji alfa, beta. Do nienasyconych kwasów tłuszczowych dołączona zostaje cząsteczka wody dając beta-hydroksykwasy. Te z kolei są utleniane przez odwodorowanie w pozycji beta, przy udziale dehydrogenazy i NAD+. Powstały tioester beta-ketokwasu przy udziale drugiej cząsteczki CoA-SH ulega tiolizie (rozpadowi) do acetylo-koenzymu A i acylo-koenzymu A (zawiera dwa węgle mniej niż poprzedni), który poddany jest ponownej beta-oksydacji. Jeden cykl obejmuje dwukrotne odwodorowanie i przenoszenie wodoru na tlen (łańcuch oddechowy) z wytworzeniem 5 cząsteczek ATP (2 cząsteczki z FADH+H, 3 cząsteczki z NADH+H) z odczepieniem acetyloCoA. Proces jest sprzężony z cyklem Krebsa i łańcuchem oddechowym. Glicerol włączony jest do procesu glikolizy. Utlenienie l g tłuszczu dostarcza 9,3 kcal. Acetylokoenzym A jest utleniony do kwasu cytrynowego w cyklu Krebsa po związaniu ze szczwiooctanem.

W razie zaburzeń cyklu Krebsa powstały uprzednio acelo-koenzym A ulega nagromadzeniu w ustroju. Acetylo-koenzym A gromadzi się nadmiernie w komórkach również w wyniku niedoboru cukrowców i zbyt intensywnego utleniania lipidów (głód przy równoczesnym dużym zapotrzebowaniu na energię). Acetylokoenzym A jest wówczas przekształcany w aceto-acetylo-koenzym A. W wyniku odłączenia koenzymu A od aceto-acetylo-koenzymu A (acetoacetylo-CoA) powstaje kwas acetooctowy (acetooctan), który w wyniku dekarboksylacji dostarcza aceton a podczas redukcji – kwas beta-hydroksymasłowy. Wskutek nadmiernego nagromadzenia ciał ketonowych w komórkach i płynach ustrojowych dochodzi do powstania ketonemii. Związki ketonowe są wydalane wraz z moczem (ketonuria) i z potem. Ketonemii towarzyszy zawsze kwasica metaboliczna. Następuje więc zaburzenie gospodarki kwasowo-zasadowej ustroju.

Anabolizm tłuszczy

Biosynteza kwasów tłuszczowych odbywa się w cytoplazmie komórek tłuszczowych (adipocyty, lipocyty). Do procesu potrzebny jest acetylokoenzym A, który powstaje w wyniku katabolizmu glukozy przy udziale dehydrogenazy pirogronianowej. W biosyntezie kwasów tłuszczowych wyróżnić można kilka etapów:

1.     Aktywacja acetylokoenzmu A przez karboksylazę do malonylo-koenzymu A w obecności ATP i witaminy H, czyli biotyny. Zatem acetylokoenzym A ulega karboksylacji do malonylokoenzymu A (malonylo-CoA).

2.     Synteza kwasów tłuszczowych na kompleksie enzymatycznym – syntetazie kwasów tłuszczowych. W skład syntetazy (kompleksu enzymatycznego) wchodzi ACP (Acyl Carrier Protein). ACP przenosi acyle, czyli produkty pośrednie. ACP zawiera z kolei panteteinę (układ 4’fosforanu panteteiny). Tworzony kwas tłuszczowy jest związany kowalencyjnie z enzymem. Reszta butylowa lub reszta acetylowa jest przeniesiona na ACP. Następnie dochodzi do połączenia reszty malonylowej pochodzącej z malonylo-koenzymu A (malonylo-CoA) z resztą acetylową, powstaje 4-węglowa cząsteczka acetoacetylo-S-ACP. Zatem zachodzi kondensacja reszty acetylowej z resztą malonylową. Wydzielony wówczas jest CO2 i HS-ACP. CO2 jest uwolniony w wyniku działania syntazy 3-oksoacylo-ACP. Przemiany te można zaliczyć do etapu startowego i etapu kondensacji.

3.     Etap redukcji odbywa się przy udziale NADPH i reduktazy 3-oksoacylo-ACP. Dochodzi do redukcji grupy –okso. Powstaje reszta beta-hydroksyacylowa, która poddana jest dehydratacji przy udziale dehydratazy 3-hydroksy-ACP. Powstaje reszta alfa, beta-dehydro-acylowa, która zostaje poddana redukcji (chodzi o wiązanie podwójne) przy udziale NADPH i reduktazy enoilo-ACP. Powstaje 4-węglowy rodnik butyrylowy. W następnym obrocie reakcji powstaje kolejna jego cząsteczka, przy czym reszta acylowa z wcześniej wytworzonego rodnika jest przeniesiona na tę następna, wydzielony jest wówczas dwutlenek węgla i powstaje reszta beta-ketoacylowa. Ta znów podlega kondensacji z kolejną. W ten sposób tworzony kwas ulega wydłużaniu do odpowiedniej masy.

4.     Uwalnianie gotowego łańcucha kwasy tłuszczowego odbywa się przy pomocy deacylazy. Odłącza ona kwas od HS-ACP, z którym był połączony, o czym wspomniano na początku.

CH3CO ~ S-CoA + 7HOOC-CH2CO~S-CoA + 14 NADPH + 14 H+ CH3(CH2)14CO~S-CoA + 7 CO2 + 7 HS-CoA + 14 NADP+ + 6H2O

Powstałe kwasy tłuszczowe są gromadzone w komórkach w postaci estrów glicerolu. Estry powstają w wyniku reakcji z glicerofosforanem = 1-fosfoglicerolem (powstaje w wyniku fosforylacji glicerolu przy udziale ATP i kinazy glicerolowej). Kinaza glicerolowa występuje w wątrobie, ale brak jej w pozostałych organach. Tam gdzie go nie ma glicerofosforan powstaje w wyniku redukcji fosforanu dihydroksyacetonu.

Najpierw zachodzi estryfikacja glicerofosforanu (estryfikacja grup –OH) pod wpływem zaktywowanych kwasów tłuszczowych (acylokoenzym A). Powstają kwasy fosfatydowe – fosforany dwuglicerydowe (diglicerydowe), a koenzym A jest uwolniony. Kolejna przemiana polega na ich defosforylacji przy udziale fosfatazy. Diglicerydy wchodzą w reakcję z cząsteczką acylo-CoA przez co powstają trójglicerydy (tłuszcze).

Reasumując: biosynteza triglicerydów (tłuszczów) zachodzi w cytoplazmie i wymaga obecności 1-fosfoglicerolu. Przyłączenie dwóch acyli do grup wodorotlenowych –OH daje kwas fosfatydowy, który ulega defosforylacji (reszta fosforanowa jest odłączona) pod wpływem fosfatazy. Powstaje alfa, beta=digliceryd, do którego przyłączony zostaje trzeci acyl z acylo-CoA. W wyniku reakcji powstaje trigliceryd.

Synteza lecytyny przebiega podobnie jak synteza triglicerydów. Powstały alfa, beta-digliceryd wchodzi w reakcję z aktywną choliną, czyli fosfocholiną (cytydynodwufosfocholina). Wwyniku reakcji powstaje lecytyna i CMP (cytydynomonofosforan). Możliwa jest także inna biosynteza lecytyny:

1.      Aktywacja kwasu fosfatydowego cząsteczką CTP (cytydynotrójfosforan), w wyniku czego powstaje CDP-alfa,beta-digliceryd oraz pirofosforan.

2.      Reakcja CDP-alfa,beta-diglicerydu z wolną choliną powstanie lecytyny.

1. Glikoliza

Glikoliza – ciąg reakcji biochemicznych, podczas których jedna cząsteczka glukozy zostaje przekształcona w dwie cząsteczki pirogronianu. Glikoliza zachodzi u wszystkich eukariotów i wielu prokariotów; przebiega w cytoplazmie

Sumaryczna reakcja glikolizy jest następująca:

glukoza + 2 Pi + 2 ADP + 2 NAD+ → 2 cząsteczki pirogronianu + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O

Etapy glikolizy

• Fosforylacja glukozy i powstanie glukozo-6-fosforanu - nieodwracalna reakcja katalizowana przez heksokinazę lub bardziej specyficznie w wątrobie przez glukokinazę. Jako dawca fosforanu potrzebny jest do tej reakcji ATP, reagujący w formie kompleksu Mg-ATP, ze względu na jednoczesną konieczność dostarczenia jonów magnezu Mg2+.

• Przekształcenie glukozo-6-fosforanu we fruktozo-6-fosforan przy pomocy izomerazy glukozo-6-fosforanowej, z zastrzeżeniem, że przemianie tej ulega tylko anomer α glukozo-6-fosforanu.

• Fosforylacja fruktozo-6-fosforanu przez ATP i przy pomocy enzymu fosfofruktokinazy I (PKF), powstaje fruktozo-1,6-bisfosforanu oraz ADP. Reakcja ta jest nieodwracalna w warunkach fizjologicznych.

• Rozszczepienie przez aldolazę fruktozo-1,6-bisfosforanu na dwie fosfotriozy - aldehyd 3-fosfoglicerynowy oraz fosfodihydroksyaceton. Dziedziczny niedobór aldolazy w erytrocytach może wywoływać niedokrwistość hemolityczną.

• Przekształcenie fosfodihydroksyacetonu w aldehyd 3-fosfoglicerynowy przez izomerazę triozofosforanową.

• Przekształcenie aldehydu 3-fosfoglicerynowego w 1,3-bisfosfoglicerynian (1,3-BPG) z użyciem fosforanu nieorganicznego, NAD+ i enzymu dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Jest to jednoczesna reakcja utleniania i fosforylacji, która może być zmodyfikowana w obecności arsenianu - reaguje on z nieorganicznym fosforanem i tworzy 1-arseno-3-fosfoglicerynian i - zamiast ATP - energię cieplną.

• Przeniesienie grupy fosforanowej z 1,3-BPG do ADP i utworzenie ATP (fosforylacja substratowa) oraz 3-fosfoglicerynianu - reakcja katalizowana przez kinazę fosfoglicerynianową.

• Przekształcenie 3-fosfoglicerynianu w 2-fosfoglicerynian przez fosfogliceromutazę. Prawdopodobnym produktem pośrednim tej reakcji jest 2,3-bisfosfoglicerynian (2,3-BPG).

• Odwodnienie 2-fosfoglicerynianu i powstanie fosfoenolopirogronianu (PEP) - reakcja katalizowana przez enolazę. Aktywność enzymu zależy od obecności jonów magnezu lub manganu, hamowana jest w obecności fluorków.

• Przeniesienie grupy fosforanowej z PEP na ADP i powstanie ATP oraz pirogronianu - reakcja katalizowana przez kinazę pirogronianową. Ze względu na znaczną utratę energii swobodnej w postaci ciepła, musi być traktowana jako reakcja fizjologicznie nieodwracalna. Dziedziczny niedobór kinazy pirogronianowej w erytrocytach może wywoływać niedokrwistość hemolityczną.