Elektroforeza, rodzaje :

Ogniskowanie izoelektryczne (IEF) - odbywa się w nośniku, w którym wartość pH

buforu zmienia się w sposób ciągły od wartości najwyższej przy katodzie do najniższej przy

anodzie. Ustalenie się gradientu pH możliwe jest dzięki zastosowaniu specjalnych nośników

pH zwanych amfolinami. Amfoteryczne substancje (białka, peptydy) migrują w polu

elektrycznym w kierunku elektrod o znaku przeciwnym ich ładunkowi. Napotykając jednak

po drodze zmieniające się wartości pH elektrolitu zatrzymują się w miejscu, w którym pH=pI.

W elektrolicie o wartości pH równej wartości pI wypadkowy ładunek makrocząsteczki równa

się zeru i obojętna elektrycznie makroczasteczka zatrzymuje się nie doznając działania sił

pola elektrycznego. Uzyskuje się w ten sposób separację molekuł białkowych zgodnie z ich

wartościami pI.

Elektroforeza strefowa może występować w różnych odmianach, z których najczęściej

używana jest:

Elektroforeza natywna - to rodzaj elektroforezy prowadzony zwykle w poliakrylamidzie

w warunkach, w których makrocząsteczki pozostają niezdenaturowane. Zaletą

tego typu separacji elektroforetycznej jest możliwość odzyskania cząsteczek białkowych

w stanie pełnej aktywności biologicznej. Wadą zaś jest stosunkowo słaba rozdzielczość

metody.

Elektroforeza dwukierunkowa (2D) - jest to połączenie dwóch, a czasami wszystkich trzech

podstawowych rodzajów elektroforezy. Procedura rozpoczyna się od separacji białek techniką

ogniskowania izoelektrycznego. Ten rodzaj separacji wykonuje się przy pomocy

elektroforezy rurkowej (elektroforeza pionowa) lub na paskach nośnika w elektroforezie

poziomej i zwany jest pierwszym kierunkiem (wymiarem) elektroforezy 1D (ang. first

dimension or 1D). Po wykonaniu tego etapu procedury nośnik zawierający rozdzielone białka

przenoszony jest na elektroforezę płytową w celu wykonania separacji według mas

cząsteczkowych (rys. 6). Na tym etapie może być stosowana elektroforeza nieciągła, w skład

której wchodzi izotachoforeza oraz elektroforeza strefowa, ale często bywa stosowana tylko

elektroforeza strefowa. Po zakończeniu procedury 2D i wybarwieniu żelu uzyskuje się

dwuwymiarową mapę rozkładu białek, gdzie współrzędnymi są wartości pI oraz masy

cząsteczkowe MW poszczególnych cząsteczek zawartych w odrębnych wybarwionych

obszarach (ang. spots) (rys. 7). Można w ten sposób rozdzielić, na jednym żelu, kilka tysięcy

białek znajdujących się w danym rodzaju komórek. Metoda ta pozwala na stosunkowo łatwą

analizę zmian ekspresji genu kodującego analizowane białko (białka) i jest wiodącą techniką

zaadoptowaną na potrzeby programu proteomiki.

Elektroforeza w obecności SDS - ten rodzaj elektroforezy jest najczęściej stosowany

dla separacji makromolekuł białkowych. Zastosowanie SDS (siarczan dodecylu sodu) -

substancji powierzchniowo czynnej - przyczynia się do znacznego poprawienia rozdzielczości

techniki elektroforetycznej. Potraktowanie cząsteczki białka przez SDS skutkuje powstaniem

15 kompleksów białko-SDS o ustalonym stosunku ładunku elektrycznego do masy. Wykazano,

że 1g białka wiąże 1,4g SDS. W kompleksie takim SDS skutecznie maskuje oryginalny

ładunek białka normalnie występujący w danym elektrolicie. Właściwość ta pozwala na łatwe

i dokładne oznaczenie mas cząsteczkowych rozdzielonych białek. Obecność SDS przynosi

szereg korzyści:

- zdecydowana większość białek jest rozpuszczalna w elektrolitach zawierających SDS,

szczególnie po redukcji mostków disiarczkowych

- separacja białek odbywa się zgodnie z ich masami cząsteczkowymi

- barwienia kompleksów białko-SDS jest znacznie wydajniejsze niż samego białka

- obecność SDS skutecznie eliminuje enzymatyczną degradację białek w trakcie separacji.