5.03.2009

Katarzyna Piaskowy
Biotechnologia, Grupa Chem2, sekcja 8

Temat: Podstawowy sprzęt laboratoryjny, zasady BHP, obserwacja komórek zwierzęcych w mikroskopie świetlnym.

Wstęp teoretyczny:

1. Opis komory Bürkera
   Komora Burkera składa się z 2 identycznych komór, podzielonych na 9 kwadratów o powierzchni 1 mm², używa się jej do liczenia komórek (lub bakterii i innych), zawartych w cieczy, która została wprowadzona pomiędzy dwa szkiełka (rysunek). Pomocne w liczeniu organizmów jest rozdzielenie „dużych kwadratów” komory na następne 16 kwadratów. Komórki martwe i żywe liczymy w 10 kwadratach (po 5 w każdej komorze), następnie liczymy ilość komórek w 1ml.
   
   
   

2. Substancje użyte do wybarwienia komórek.
   -Błękit trypanowy (C₃₄H₂₄N₆O₁₄ S₄Na₄) barwi martwe komórki na niebiesko lub granatowo (żywe komórki z nienaruszoną błoną są niezabarwione).
   -Erytrozyna B (C₂₀H₆J₄Na₂O_{5 ∙°}H₂O) barwi martwe komórki na kolor wiśniowo-czerwony.

Wykonanie ćwiczenia:

Do wykonania obserwacji użyłyśmy komórek K-562 (żyją one w zawiesinach, dlatego nie została przeprowadzona trypsynizacja ). Z próbówki Eppendorfa pobrałyśmy 30 µl zawiesiny komórek. Następnie tę próbkę rozcieńczyłyśmy w stosunku 1:1 i otrzymałyśmy 60µl rozcieńczonego roztworu. Zawartość tej próbówki rozdzieliłyśmy na dwie części o takiej samej objętości. Mając próbkę z 30 µl rozcieńczonego już roztworu dodałyśmy 30 µl barwnika. Nasza sekcja wykorzystała barwnik: erytrozynę B. Wymieszałyśmy otrzymaną mieszaninę i naniosłyśmy dwa razy po 10µl na komorę Bürkera. Komorę Bürkera umieściłyśmy pod mikroskopem i obserwowałyśmy zabarwione lub nie komórki, które znajdowały się w 18 kwadratach. Wybrałyśmy do obserwacji i zliczyłyśmy komórki będące w obrębie 10 kwadratów.

Wyniki:

Z naszych obserwacji wynika:
I „duży” kwadrat:

• 35 zabarwionych komórek

• 16 niezabarwionych komórek

II „duży” kwadrat:

• 16 zabarwionych

• 14 niezabarwione

Komórki barwione erytrozyną B
Numer kwadratu
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Suma:
Łączna suma:
Średnia ilość komórek na kwadrat:
Ilość komórek w 1 ml (suma komórek z 10 kwadratów *1000)
Stosunek procentowy:

• 51 zabarwionych

Komórki barwione błękitem trypanowym
Numer kwadratu
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Suma:
Łączna suma:
Średnia ilość komórek na kwadrat:
Ilość komórek w 1 ml (suma komórek z 10 kwadratów *1000)
Stosunek procentowy:

• 30 niezabarwionych

= 81komórki

Tabela przedstawia rozmieszczenie komórek w poszczególnych kwadratach oraz porównanie z wynikami sekcji wykonującej ćwiczenie w tym samym czasie ale z użyciem innego barwnika (błękitu trypanowego).

Różnica pomiędzy śmiertelnością komórek:	61%-35%= 26 %

Porównanie wyników na tle innych sekcji(bez rozdzielenia na rodzaje barwników):

1.Ogólna liczba komórek 2.Procentowe porównanie komórek żywych i martwych

Wnioski:
Różnica między śmiertelnością komórek jest bardzo duża w porównaiu z sekcją „bliźniaczą”(mimo że średnia liczba komórek żywych na kwadrat jest porównywalna), ale w stosunku do całej grupy wykonującej ćwiczenie dane nie różnią się tak bardzo. Uważamy, że nie jest to spowodowane toksycznością barwnika lecz różnicami w pomiarach i sposobie wykonania ćwiczenia. Barwnik „zabija” żywe komórki i dlatego im dłuższy czas od jego wprowadzenia do zaczęcia obserwacji, tym większa śmiertelność organizmów. To wyjaśnia czemu śmiertelność w wykonywanym przez nas doświadczeniu jest tak duża i tak różna. Druga sekcja od razu zaczęła obserwację, a w naszej wyregulowanie mikroskopu i zaaplikowanie preparatu do komory Burgera zajęło o wiele więcej czasu.

Na liczbę komórek w preparacie miało wpływ: rozcieńczenie i sposób w jaki zostało wykonane(jego dokładność), wytrząsanie zarówno po wprowadzeniu wody destylowanej, jak i po przenoszeniu części roztworu z jednej próbówki do drugiej.

Duży wpływ miał również wybór kwadratów (z których liczyliśmy komórki), organizmy powinny być rozłożone równomiernie ale w niektórych przypadkach (spowodowane jest to złym rozcieńczeniem, wymieszaniem) w kwadratach, których nie brałyśmy pod uwagę były nierównomiernie rozłożone duże skupiska komórek(lub ich brak).