Sprawozdanie

Skład sekcji: Data:

LESZCZORZ Kinga 20.04.2015r.

MILIC Paulina 27.04.2015r.

STULA Sergiusz

SERAFIMOWICZ Weronika

TEMAT ĆWICZENIA:

Izolacja i badanie właściwości szczepów z rodzaju Bacillus.

CEL ĆWICZENIA:

Charakterystyka bakterii z rodzaju Bacillus oraz ocena ich zdolności do produkowania enzymów o znaczeniu przemysłowym.

WSTĘP TEORETYCZNY:

Rodzaj Bacillus stanowią gramdodatnie lub gramzmienne, cylindryczne, zwykle ruchliwe komórki. Mikroorganizmy należące do rodzaju Bacillus są z reguły katalazododatnie, tlenowe
lub względnie beztlenowe. Charakteryzują się wysokim stopniem zróżnicowania fizjologicznego
oraz metabolicznego uwarunkowanego różnorodnością genetyczną. Drobnoustroje te mogą bytować
w środowiskach o dużej rozpiętości temperatur, pH oraz zasolenia. W obrębie rodzaju wyróżnić można zarówno organizmy termofilne, izolowane z gorących źródeł wulkanicznych,
jak i psychrofilne, rosnące w temperaturze 0°C. Ponadto, wyróżnia się tutaj zarówno gatunki alkalifilne, jak i acydofilne. Gatunki z rodzaju Bacillus charakteryzują się dużą szybkością wzrostu, wydajnym systemem syntezy i sekrecji białek zewnątrzkomórkowych. Co więcej, większość z nich stanowią gatunki bezpieczne dla ludzi i zwierząt (posiadają status GRAS, z ang. Generally Recognized As Safe), wyjątek stanowi patogenny gatunek B. anthracis oraz blisko z nim spokrewniony B. cereus. Powyższe cechy bakterii Bacillus sp. są przyczyną ich częstego zastosowania do produkcji preparatów komercyjnych, w tym enzymów, antybiotyków, insektycydów, witamin, a także innych metabolitów (kwas hialuronowy, poligalakturonowy). Bakterie z rodzaju Bacillus są szeroko rozpowszechnione
w naturze. Izoluje się je z gleby, wód słodkich oraz słonych, ale także z przewodu pokarmowego zwierząt czy z psującej się żywności. Przyczyną takiej sytuacji jest zdolność tych bakterii
do tworzenia endospor, pozwalających przeżyć w niekorzystnych warunkach środowiskowych.

Przetrwalniki są strukturami spoczynkowymi bakterii określanymi również jako bakterie
w fazie ,,pauzy metabolicznej” lub jako bakterie w stanie ,,śmierci pozornej”. Ten stan uśpienia może trwać długi okres czasu - nawet kilkaset lat w warunkach krytycznych. Endospory są oporne na brak substancji odżywczych w środowisku, zmienność temperatur w szerokich zakresach, wysuszenie, środki dezynfekcyjne i inne substancje chemiczne, enzymy, promieniowanie UV itp. Endospory wytwarzane są w procesie zwanym sporulacją, który jest odwracalny, gdyż może ponownie dochodzić do powstawania komórki wegetatywnej, gdy tylko w środowisku pojawią się korzystne warunki. Ten odwrotny do sporulacji proces zwany jest germinacją lub inaczej kiełkowaniem przetrwalników.

Przydatność biotechnologiczna laseczek Bacillus sp. wynika z ich zdolności do produkcji enzymów zewnątrzkomórkowych – głównie proteaz (hydroliza wiązań peptydowych), lipaz (hydroliza wiązań estrowych w tłuszczach), amylaz (hydroliza wiązań α-glikozydowych w skrobi i innych polisacharydach) i glukanaz (hydroliza wewnątrzcząsteczkowych wiązań β -glikozydowych w celulozie). Amylazy produkowane przez gatunki Bacillus to: α-amylaza, β-amylaza, izoamylaza, β-galaktozydaza, α-glukanaza, β-glukanaza. Z grupy enzymów proteolitycznych Bacillus sp. produkują proteazy alkaliczne oraz proteazy neutralne.

Amylazy wykorzystywane do hydrolizy skrobi są najczęściej stosowanymi enzymami w przemyśle spożywczym. Skrobia jest to jest polisacharyd zbudowany z cząsteczek D-glukozy, które są połączone wiązaniami alfa-glikozydowymi. Skrobia jest zbudowana z dwóch składników strukturalnych amylozy
i amylopektyny.

METODYKA BADAŃ:

Izolacja szczepów Bacillus z gleby:

• Odmierzono 5g przygotowanej gleby doniczkowej, którą następnie rozcieńczono do 10⁻¹.

• Próbę wytrząsano przez 10 min po czym pozostawiono do sedymentacji.

• Po zsedymentowaniu przygotowano kolejne rozcieńczenia 10⁻², 10⁻³,  10⁻⁴.

• Próbki inkubowano przez 10 min w temperaturze 80°C, a następnie wystudzono.

• Z przygotowanych roztworów wykonano posiew powierzchniowy na płytki Petriego z zestalonym podłożem agarowym.

• Próby poddano tygodniowej inkubacji.

Identyfikacja wyizolowanych szczepów metodą Grama, wykrywanie przetrwalników:

• Na odtłuszczone i czyste szkiełko podstawowe nałożono kroplę soli fizjologicznej.

• Następnie nałożono materiał biologiczny i rozprowadzono go na całej powierzchni.

• Utrwalono próbkę nad palnikiem i ostudzono.

• Na płytkę na 2 min nałożono fiolet krystaliczny, po czym został spłukany wodą destylowaną.

• Następnie szkiełko pokryto płynem Lugola i spłukano wodą destylowaną po 1,5 min.

• Dalej na 30 sekund nałożono etanol w celu odbarwienia bakterii gram ujemnych.

• Na koniec dobarwiono próbkę fuksyną.

• Osuszone szkiełko podstawowe poddano obserwacji mikroskopowej.

Określenie zdolności wyizolowanych szczepów Bacillus do produkcji enzymów amylolitycznych:

• Na specjalną porcelanową płytkę nałożono 3 x 1 ml wody destylowanej.

• Do pierwszego i trzeciego dołeczka dodano 3 ezy bakterii (10⁻³) wyrosłych na podłożu bulion-agar.

• Następnie do wszystkich trzech dołeczków dodano 1 ml 2% roztworu skrobi.

• Do tak przygotowanych prób dodano po 1 ezie płynu Lugola i rozpoczęto 30 minutową obserwację.

Określenie zdolności wyizolowany szczepów Bacillus do produkcji enzymów lipolitycznych:

• Kolonie wyrosłe na podłożu z dodatkiem tłuszczu zalano 20% roztworem siarczanu miedzi (II),
  a następnie poddano obserwacji.

Określenie zdolności wyizolowany szczepów Bacillus do produkcji enzymów proteolitycznych:

• Powierzchnię płytki przesianej redukcyjnie z żelatynowym podłożem Fraziera zalano odczynnikiem Fraziera po czym poddano 5 min inkubacji.

• Następnie odpipetowano nadmiar płynu i poddano obserwacji.

Ocena aktywności proteolitycznej oraz amonifikacyjnej wyizolowanych szczepów Bacillus:

• Kolonie wyrosłe w probówce z 1% wodą peptonową poddano wstępnej obserwacji.

• Następnie do probówki dodano 5 kropel odczynnika Nesslera i obserwowano zmiany.

WYNIKI BADAŃ I ICH OMÓWIENIE:

Obserwacje otrzymanych hodowli:

Na podłożu stałym zaobserwowano wzrost pojedynczych kolonii grzybów oraz bakterii, w tym tych z rodziny Bacillus. Były to białe, rozgałęzione kolonie.

Liczebność bakterii cfu/ml:

Wyniki barwienia Grama:

Podczas obserwacji mikroskopowej zaobserwowano obecność pałeczek gram dodatnich. W niektórych z nich widoczne były nie uwolnione jeszcze przetrwalniki.

Wyniki aktywności amylolitycznej, lipolitycznej, proteolitycznej,amonfikacyjnej

	Aktywność amylolityczna	Aktywność lipolityczna	Aktywność proteolityczna	Aktywność amonifikacyjna
Sekcja I	+	-	+	+ (zabarwienie na żółto)
Sekcja II	+	-	+	+ (zabarwienie na żółto)
Sekcja III	+	-	+	+ (zabarwienie na żółto)

Aktywność amylolityczna:

Przeprowadzono test z płynem Lugola. Udowodniono, że bakterie przeprowadzają rozkład skrobi. W trakcie hydrolizy enzymatycznej skrobia rozpada się na coraz krótsze łańcuchy polisacharydowe tworząc amylodekstryny (o zabarwieniu niebieskim), następnie erytrodekstryny (o zabarwieniu czerwonym), dalej achrodekstryny (nie barwiące się z jodem) i na końcu rozkładana jest do maltozy i glukozy. Mieszanina nr 3 uległa odbarwieniu, który występuje pomiędzy obecnymi w płynie Lugola cząsteczkami jodu i anionami polijodkowymi, a cząsteczką D-glukozy łańcucha amylozy jako części skrobi. W drugiej próbie nie nastąpiło odbarwienie, ponieważ w mieszaninie nie występowały bakterie rozkładające skrobię. W pierwszej próbie nie nastąpiło zabarwienie, ponieważ nie zawierała ona skrobi, z którą płyn Lugola mógłby stworzyć barwne kompleksy .

Aktywność lipolityczna:

Stwierdzono brak aktywności lipolitycznej bakterii. Na podłożu z dodatkiem CuSo₄ nie zaobserwowano zmiany barwy na linii posiewów na kolor chabrowy, który informowałby o zdolnościach bakterii do hydrolitycznego rozkładu tłuszczów. Zabarwienie nastąpiłoby w przypadku powstania kompleksów glicerolu lub wolnych kwasów tłuszczowych z jonem miedzi.

Aktywność proteolityczna:

Na liniach posiewu zaobserwowano białe zabarwienie. Ponieważ podłoże zawiera żelatynę i agar, stąd rozłożenie żelatyny nie uwidacznia się upłynnieniem podłoża. Wykryto je w reakcji z odczynnikiem Fraziera, który dał z nie rozłożonym białkiem strąt barwiący podłoże na kolor mleczny. Następuje to w efekcie wysalania pozostałości białkowych po rozkładzie białek i zachodzi dzięki obecności rtęci w odczynniku. Wokół kolonii proteolitycznych widniały strefy klarownej pożywki.

Aktywność amonifikacyjna :

Badanie aktywności przeprowadzono za pomocą odczynnika Nesslera. Zawiera on bezbarwny roztwór tetrajodortęcianu (II) potasu. Dzięki niemu następuje wykrycie jonów NH₄⁺. Próby zabarwiły się na żółty kolor, który świadczy o pozytywnym wyniku, czyli powstaniu  [Hg₂N]I.

WNIOSKI:

Na podstawie otrzymanych wyników z barwienia grama stwierdzono obecność przetrwalników Bacillus sp. Z wykorzystaniem tych mikroorganizmów wykonano pozostałe testy badające ich aktywności amylolityczne, proteolityczne, lipolityczne jak i amonifikacyjne. Stwierdzono, iż posiadają tylko niektóre z nich. Mianowicie rozkładały one cukry, białka oraz prowadziły proces przemiany azotu zawartego w związkach organicznych do amoniaku. Nie wykazały jednak zdolności do rozkładu tłuszczów.