Sprawozdanie

Skład sekcji: Data:

LESZCZORZ Kinga 02.03.2015r.

MILIC Paulina 09.03.2015r.

STULA Sergiusz 16.03.2015r.

SERAFIMOWICZ Weronika

TEMAT ĆWICZENIA:

Pozyskiwanie mikroorganizmów zdolnych do biodegradacji związków ksenobiotycznych.

CEL ĆWICZENIA:

Przeprowadzenie skriningu, aby pozyskać mikroorganizmy zdolne do rozkładu związków ksenobiotycznych, występujących w wodach przemysłowych.

WSTĘP TEORETYCZNY:

W celu pozyskania mikroorganizmów zdolnych do biodegradacji związków ksenobiotycznych można zastosować metodę skriningu. Pozyskanie mikroorganizmów o pożądanych cechach obejmuje następujące etapy: - wybór miejsca i pobranie próbek, wstępna obróbka materiału biologicznego, namnożenie drobnoustroi i otrzymanie czystych kultur, test przydatności wyizolowanych szczepów do wytwarzania określonych produktów lub rozkładu substratów. Fenol i katechol są to związki ksenobiotyczne, gdyż w naturalnym środowisku nie możemy zaobserwować ich w przyrodzie. Są związkami aromatycznymi o działaniu toksycznym. Fenol działa toksycznie na niektóre mikroorganizmy, a w przypadku innych może hamować ich rozwój. Działa drażniąco na błony śluzowe, skórę, oczy, a w niektórych przypadkach może nawet prowadzić do martwicy tkanek. Wchłonięty do organizmu zakłóca prawidłową pracę układu nerwowego oraz może powodować ból mięśni, zawroty głowy, obniżenie temperatury i spadek ciśnienia krwi, a w skrajnych przypadkach śmierć. Katechol działa zaś drażniąco na skórę oraz układ oddechowy. W przypadku zatrucia może również powodować bóle głowy oraz spadek ciśnienia krwi, a dodatkowo arytmię, duszności, cyjanozę i w ostateczności śpiączkę.

METODYKA BADAŃ:

• Pochodzenie próby środowiskowej: Próba środowiskowa została pobrana ze stawu „Rzęsa” w pobliżu wysypiska śmieci „Landeco” w Siemianowicach Śląskich.

• Podłoże wykorzystane do selekcji szczepów opornych na związki ksenobiotyczne:

Podłoże z zestaloną pożywką Kojima ze zmniejszoną do 0,1 g/l ilościa ekstraktu drożdżowego zawierającego witaminę B - wspomagającą wzrost bakterii.

• Jakie substancje wykorzystano jako jedyne źródło węgla i energii w użytym podłożu: W użytym podłożu wykorzystano katechol i fenol . Bakterie w różnym szlaku rozkładu pierścienia aromatycznego (meta bądź orto) wykorzystały te związki jako jedyne źródło węgla.

• W jaki sposób przeprowadzono oczyszczenie szczepu ? : Z tak uzyskanych hodowli wybrano pojedyncze kolonie i oczyszczono je metodą posiewu redukcyjnego na płytkach Petriego z zestalonym bulionem agarowym.

• W jaki sposób nastąpiła identyfikacja szczepu ? : W celu zaklasyfikowania bakterii do odpowiedniej grupy bakterii gram dodatnich lub gram ujemnych wykonano barwienie metodą Grama, zabarwiając bakterie gram dodatnie na fioletowo, bądź ujemne na różowo, zgodnie z schematem dodając kolejno: fioletu krystalicznego, Plynu Lugola, etanolu oraz na końcu dobarwiając fuksyną bakterie gram ujemne (których nie było).

• W jaki sposób założono hodowlę degradacyjną ? : Kolonie przesiano na skosy agarowe w celu przeprowadzenia hodowli degradacyjnej.

• W jaki sposób oznaczono stężenie fenolu oraz katecholu w badanych hodowlach degradacyjnych? : Aby oznaczyć stężenie katecholu i fenolu kolonie wyrosłe na skosach agarowych w sterylnych warunkach spłukano do kolb zawierających pożywkę Kojima. Następnie dodano odpowiednią ilość roztworu fenolu lub katecholu, aby stężenie substratu wyniosło 5mM. Hodowle te były prowadzona przez okres 1 tygodnia. Po tym czasie oznaczono stężenie fenolu wykorzystując metodę kolorymetryczną polegającą na barwnej reakcji jednowodorotlenowych fenoli z dwuazowaną p-nitroaniliną w środowisku alkalicznym. W tym celu przygotowano odpowiednią mieszaninę i oznaczono jej absorbancję przy długości fali 560 nm, Oznaczono także stężenie katecholu posługując się metodą polegającą na reakcji molibdenianu sodu z kwasem solnym, azotynem sodu i wodorotlenkiem sodu. Przygotowano odpowiednią mieszaninę i oznaczono na spektrofotometrze przy długości fali 480 nm. Stężenie obu związków ksenobiotycznych odczytano z krzywej wzorcowej.

WYNIKI BADAŃ:

• Liczebność bakterii na podłożach selekcyjnych zawierających ksenbiotyki:

MIEJSCE POBORU PRÓBKI - SEKCJE	FENOL ROZC. 10^-1	FENOL ROZC. 10^-2	KATECHOL ROZC. 10^-1	KATECHOL ROZC. 10^-2
BYTOMKA – SEKCJA 1	1 kolonia = 1*10*10 = 100 CFU /ml	Nie policzalne	5 koloni = 5*10*10 = 500 CFU/ml	3 kolonie = 3*10*10 = 300 CFU/ml
STAW „RZESA” - SEKCJA 2	________	_________	________	_______
KŁODNICA - SEKCJA 3	11 koloni = 11*10*10 = 11 000 CFU/ml	________	________	_______

• Wynik barwienia metodą Grama badanego szczepu:

Dzięki utworzeniu się w ścianie komórkowej bakterii gram dodatnich (zawierającej mureinę) trwałego kompleksu fioletu krystalicznego z jodem obecnym w płynie Lugola, bakterie zostały trwale zabarwione na fioletowo.

• Krzywe wzorcowe dla fenolu oraz katecholu:

KRZYWA KALIBRACYJNA DLA OZNAZCZANIA STĘŻENIA FENOLU

KRZYWA KALIBRACYJNA DLA OZNAZCZANIA STĘŻENIA KATECHOLU

• Pomiar gęstości optycznej hodowli przy długości fali 600nm

SEKCJE	FENOL	KATECHOL
SEKCJA 1	0,108	0,146
SEKCJA 2	0,100	0,330
SEKCJA 3	MARYSIA MIALA PODAC	0,110

• Obliczone stężenie fenolu oraz katecholu w hodowlach degradacyjnych:

OZNACZENIE	DŁUGOŚĆ FALI [nm]	SEKCJE	t0	t1
KOLORYMETRYCZNE OZNACZENIE FENOLU	560	S1	5 mM	10,47 mM
		S2	5 mM	6,806 mM
		S3	5 mM	7,95 mM
KOLORYMETRYCZNE OZNACZENIE KATECHOLU	480	S1	5 mM	0,891 mM
		S2	5 mM	1,12 mM
		S3	5 mM	3,98 mM

OBLICZENIA:

• Objętości roztworów fenolu I katecholu dodawanych do podłoży stałych (ćwiczenie nr 1)

Dysponujemy: - 0,25 M roztwór fenolu

- 0,5 M roztwór katecholu

Chcemy aby steżenie tych związków w podłożu wynosiło1mM .

Objętość podłoża – 10 ml = 10 cm³ = 0,01 dm³

1 mM ---- znajduje się w 1 dm³

x mM ---- znajduje się w 0,01 dm³

x = 0,01 mM

FENOL:

0,25 M = 250 mM ^----- 1 dm³

0,01 mM ---- x dm³

x = 4*10^-5 dm³ = 4*10^-5 l = 40 μl

KATECHOL:

0,5 M = 500 Mm ---- 1 dm³

0,01 mM ---- x dm³

x = 2*10^-5 dm³ = 2*10^-5l = 20 μl

• Objętości roztworów fenolu I katecholu dodawanych do hodowli degradacyjnych (ćwiczenie nr 2)

Dysponujemy: - 0,25 M roztwór fenolu

- 0,5 M roztwór katecholu

Chcemy aby stężenie tych związków w kolbie wynosiło5mM .

Objętość podłoża – 100 ml = 100 cm³ = 0,1 dm³

5mM ---- znajduje się w 1 dm³

x mM ---- znajduje się w 0,1 dm³

x = 0,5 mM

FENOL:

0,25 M = 250 mM ^----- 1 dm³

0,5 mM ---- x dm³

x = 2*10^-3 dm³ = 2*10^-3l = 2 ml

KATECHOL:

0,5 M = 500 Mm ---- 1 dm³

0,5 mM ---- x dm³

x = 1*10^-3 dm³ = 1*10^-3l = 1 ml

• Stężenia fenolu i katecholu pozostałe w hodowlach degradacyjnych i przyswojone przez mikroorganizmy (przeliczone na podstawie krzywych wzorcowych)

WZORY KRZYWEJ:

DLA FENOLU – y = 0,955*x

DLA KATECHOLU – y = 3,7269*x

Absorbancja znajduję się na osi y, dlatego do obliczenia stężen katecholu i fenolu musimy przekształcić wzory krzywych w taki sposób aby otrzymać x:

FENOL - $x = \frac{y}{0,955}$

KATECHOL - $x = \frac{y}{3,7269}$

Jadnak aby obliczyć końcowe stężenie, trzebą otrzymanego x pomnożyć przez rozcieńczenie.

W przypadku fenolu jest to rozcieńczenie 1:500 ( na 10 μl hodowli 4990 μl wody destylowanej) dlatego wynik w poprzednim równaniu trzeba pomnożyc przez 500.

W przypadku katecholu jest to rozcieńczenie 1:10 ( na 0,1 mlhodowli 0,9 mlwody destylowanej) dlatego wynik w poprzednim równaniu trzeba pomnożyc przez 10.

FENOL - $x = \frac{y}{0,955}*500$

KATECHOL - $x = \frac{y}{3,7269}*10$

WNIOSKI:

Na podstawie wyników liczebności mikroorganizmów można ocenić, iż najbardziej narażoną na kontakt z fenolem i katecholem jest rzeka Bytomka. W próbkach obranych przez sekcje znajdowały się mikroorganizmy zdolne do przyswojenia zarówno katecholu jak i fenolu. Natomiast w rzece Kłodnica zauważono obecność wyłącznie bakterii transformujących fenol. Były one obecne wyłącznie w najmniejszym rozcieńczeniu. Wynik ten na podstawie wcześniejszych lat sugeruje, iż do rzeki dostaje się coraz mniej zanieczyszczeń. Na podstawie wyników badań próbek z jeziora Rzęsa można wnioskować, iż nie występuje w niej zanieczyszczenie katecholem i fenolem.

Na podstawie wyników z hodowli degradacyjnych możemy wnioskować, iż otrzymane hodowle organizmów nie miały zdolności do rozkładu fenolu,  jednak potrafiły rozłożyć katechol (co potwierdza fakt, że katechol jest łatwiej biodegradowalny). Wynik informuje nas, że otrzymane szczepy bakterii nie produkowały monooksygenazy fenolowej, która umożliwia przekształcenie fenolu do katecholu. Jest to istotna właściwość, gdyż tylko przez takie przekształcenie związku mikroorganizmy mogą go przyswoić. U każdej sekcji zauważono, iż stężenie fenolu jest wyższe niż zakładano. Spowodowane może być to błędami w przygotowaniu prób i niedokładnością spektrofotometru.  Należy również dodać, iż katechol ulega samorzutnemu przekształceniu pod wpływem światła do form chinonowych, co można poznać po ciemnym zabarwieniu hodowli. Proces ten również może wpływać na zawyżenie naszych wyników.

LITERATURA:

1. ZIEMBIŃSKA A., WIECHETEK A.: Laboratorium mikrobiologiczne – wybrane ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i stosowanej – Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, 2010

2. SCHLEGEL G. H.: Mikrobiologia ogólna – Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003

3. KOŁWZAN B., ADAMIAK W., GRABAS K., PAWEŁCZYK A.,: Podstawy Mikrobiologii w Ochronie Środowiska – Wydawnictwo Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2005