Griffith – aktywacja nieletalnego szczepu przez transformację z inaktywowanym letalnym
Avery – transformujący czynnik – DNA; po usunięciu białek, lipidów itp. Letalny szczep transformuje nieletalny
Hershey + Chase – tylko DNA niesie informację, radioaktywne siarka + fosfor
Meselson i Stahl – replikacja semikonserwatywna
B-DNA ma konformację prawoskrętną i charakteryzuje się występowaniem rowka dużego i rowka małego.
Z-DNA ma konformację lewoskrętną, ma pojedynczy rowek, może występować na ograniczonych odcinkach DNA.
A-DNA występuje najrzadziej, występuje w stanie bezwodnym, ma rowek duży i płaski rowek mały.
Episomy – plazmidy integrujące z chromosomem i replikowane razem z nim. R – oporność na antybotyki, F – episomy; C – kolicyny zabijające bakterie, degradacyjne, wirulencji.
Repliosom: gyraza, helikaza, prymaza, polimerazy, ligaza, SSB
W chromosomie E. coli jest sześć regionów terminacji: ADE w jednej orientacji, BCF w drugiej.
Szybkość replikacji: E. coli – 1000 nukleotydów/s, Eucaryota – 100 nukleotydów/s;
Szybkość transkrypcji E.coli – 50 nukleotydów/s
Może dochodzić do regulacji transkrypcji dzięki zamiany podjednostki sigma w polimerazie RNA
Epigenetyka – zmiana w ekspresji genów bez zmian w sekwencji DNA.
Metylacja C zachodzi dzięki DNMT
Telomery nie są upakowane w postaci nukleosomów, mają strukturę poczwórnej helisy (DNA zorganizowane jest w postaci pętli).
Satelity mogą występować na końcach krótkich ramion chromosomów akrocentrycznych z wyjątkiem chromosomu Y. Przewężenie przed satelitami jest odcinkiem jąderkotwórczym chromosomów (organizator jąderkowy – Nuclear Organizer Region, NOR). Odcinki NOR charakteryzują się powtarzalnościa sekwencji nukleotydów rDNA (kodującego pre-rRNA).
Chromosomy człowieka podzielone zostały na grupy:
Grupa A: duże chromosomy 1-3, 1 i 3 metacentryczne, 2 submetacentryczny,
Grupa B: duże chromosomy 4 i 5, submetacentryczne,
Grupa C: średnie chromosomy 6-12 oraz X, submetacentryczne,
Grupa D: duże chromosomy 13-15, akrocentryczne,
Grupa E: małe chromosomy 16-18, 16 metacentryczny, 17 i 18 submetacentryczne,
Grupa F: najmniejsze chromosomy 19-20, metacentryczne,
Grupa G: najmniejsze chromosomy 21, 22, akrocentryczne oraz Y akrocentryczny bez satelitów.
Oprócz powtórzeń tandemowych w DNA występują też sekwencje powtórzone rozproszone. Sekwencje rozproszone dzieli się na SINE (short interspersed nuclear elements) i LINE (long i.n.e.) oraz elementy LTR (long terminal repeats – rozpoczynające i kończące sekwencje genów retrowirusów).
VNTR – polimorfizm liczby powtórzeń tandemowych (variable number of tandem repeats).
Długość powtórzeń mikrosatelitarnego DNA jest cechą osobniczą. Stosując PCR można analizować VNTR i tym samym identyfikować daną osobę.
Badanie VNTR znajduje zastosowanie w kryminalistyce (identyfikacja sprawcy), medycynie sądowej (ustalanie ojcostwa), doborze organów do przeszczepu, identyfikacji chorób genetycznych.
U Eukaryota cykl komórkowy jest regulowany w bardzo skomplikowany sposób.
Wyjście komórki z fazy G0 stymulowane jest przez hormony wzrostu.
Cykl może być zatrzymany dzięki obecności przynajmniej dwóch punktów restrykcyjnych (kontroli) ulokowanych na granicach faz G1/S oraz G2/M. Przejście cyklu komórkowego możliwe jest jeśli w określonych punktach kontroli komórka spełnia odpowiednie warunki.
Na granicy G1/S odbywa się kontrola integralności materiału genetycznego. Przy uszkodzeniu DNA uruchamiane są procesy naprawcze. Przejście przez fazę G1 indukowane jest przez mitogeny (czynniki wzrostu) uruchamiające produkcję cyklin D (D1, D2, D3). One z kolei aktywują kinazy Cdk4 i Cdk6.
Przejście przez G1 może być zablokowane przez aktywację białka p53 spowodowaną wykryciem uszkodzenia DNA.
Przejście fazy G2 warunkuje połączenie białka cdc2 (Cdk1) z cyklinami A i B. Uszkodzenia komórki uniemożliwiają przejście punktu kontrolnego G2.
G1/S: kontrola rozmiaru komórki, DNA. Kontrola pełniona przez cyklinę E + Cdk2
G2/M: stan fizjologiczny komórki, replikacja lub uszkodzenia DNA. Kontrola pełniona przez cyklinę A + Cdk2, cyklinę B + Cdk1
Zniszczenia DNA kontrolowane są przez białko p53.
Łańcuchy lekkie – 2, 22, ciężkie – 14 chromosom
Ogromna zmienność sekwencji aminokwasów w przeciwciałach nie może być kodowana przez odrębne geny.
Przyczyny różnorodności przeciwciał:
liczne segmenty w genach linii zarodkowej kodują cząsteczki o różnej specyficzności
rekombinacja somatyczna (rekombinacja + delecje + insercje bezmatrycowe)
mutacje somatyczne (punktowe, częstotliwość 106 razy większa niż w innych genach)
Dopuszczana różnorodność przeciwciał rodzi możliwość powstawania chorób autoimmunologicznych (cukrzyca typu I, miastenia gravis) lub niektórych nowotworów (chłoniak Burkitta).
MHC klasy I prezentują antygeny wewnątrzkomórkowe limfocytom Tc (killer – cytotoksycznym, T CD8+). Po rozpoznaniu obcego białka komórka zostaje zabita.
MHC klasy II prezentują antygeny pozakomórkowe (egzogenne) limfocytom Th (pomocniczym, T CD4+). Limfocyty Th wydzielają cytokiny biorące udział w rozwijaniu odpowiedzi komórkowej (Th1) lub humoralnej (Th2).
Prezentacja krzyżowa – biorą w niej udział zarówno limfocyty Tc jak i Th. Komórkami prezentującymi antygen są komórki dendrytyczne (wykorzystujące MHC klasy I i II). Pobudzone limfocyty Tc nie zabijają komórek dendrytycznych ale znajdują inne komórki z odpowiednimi antygenami na powierzchni. Prezentacja krzyżowa jest ważna w odpowiedzi na czynniki (wirusy, bakterie, nowotwory) nie infekujące komórek prezentujących antygeny.
Przesunięcie tautomeryczne – formy tautomeryczne zasad azotowych mogą tworzyć nietypowe (niehomologiczne) połączenia z innymi zasadami: A=C lub TG
Deaminacja – usunięcie grupy aminowej z cytozyny, adeniny lub guaniny daje zasadę o odmiennej możliwości parowania (działanie np. kwasu azotawego, nitrozamidu).
Analogi zasad nukleotydowych – cząsteczki puryn lub pirymidyn o własnościach zbliżonych do zasad azotowych DNA. 5-bromouracyl (BrU) jest analogiem tyminy ale obecność bromu umożliwia wiązanie BrU również z guaniną.
Dimery cyklobutylowe – działanie promieniowania UV może powodować powstawanie kowalencyjnych wiązań pomiędzy sąsiadującymi cząsteczkami np. tyminy. Zmniejszenie odległości pomiędzy nukleotydami prowadzić może do delecji przy replikacji.
Transpozycja – przemieszczenie fragmentów DNA (transpozonów) pomiędzy różnymi pozycjami wewnątrz genomu. Transpozycja zachodzi rzadko – raz na około 103 – 104 podziałów komórkowych.
Inwersja – odwrócenie fragmentu chromosomu o 180°. Inwersja obejmująca centromer – pericentryczna (eucentryczna). Inwersja nie obejmująca centromeru – paracentryczna (acentryczna).
Translokacja – przemieszczenie fragmentu chromosomu w obrębie tego samego lub innego chromosomu.
Translokacja wzajemna – wymiana pomiędzy chromosomami niehomologicznymi.
Translokacja zrównoważona – całkowita wymiana pomiędzy chromosomami, nie ma dodatkowych lub brakujących genów.
Translokacja niezrównoważona – wymiana niecałkowita, pojawiają się dodatkowe lub brakujące geny.
Translokacja robertsonowska (fuzja centryczna) – łączenie się całych (lub prawie całych) ramion długich chromosomów akrocentrycznych lub telocentrycznych i utrata ramion krótkich. W fuzjach najczęściej uczestniczą chromosomy 14 i 21.
Chromosom kolisty – powstaje w wyniku pęknięcia i połączenia końców chromosomu (u człowieka 4, 13, 18 oraz X).
Izochromosom – powstaje wskutek nieprawidłowego, poprzecznego podziału centromeru chromosomu metafazowego. Mogą powstawać z autosomów oraz chromosomu X.
Rekombinacja homologiczna – proces zachodzący podczas crossing-over jest również używany do naprawy dwuniciowych uszkodzeń DNA. Naprawa odbywa się w późnej fazie S/G2.
W modelu Holliday’a rekombinacja odbywa się pomiędzy dwoma przerwami w pojedynczych niciach dupleksu DNA.
Replikacja płytkowa pozwala w szybko sposób identyfikować zmutowane szczepy bakteryjne.
PCR (polymerase chain reaction) – łańcuchowa reakcja polimerazy. Polimeraza DNA musi być termostabilna - stosuje się np. polimerazę z Thermopilus aquaticus (polimeraza Taq).
W optymalnych warunkach wydłużenie syntetyzowanej nici DNA wynosi około 1000 nukleotydów/min. Etapy to: inicjalizacja, denaturacja, łączenie, wydłużenie, zatrzymanie. Zastosowanie:
selektywna amplifikacja specyficznych regionów DNA
sekwencjonowanie DNA
znajdowanie genetycznych „odcisków palców”
konstrukcja rekombinowanego DNA
diagnozowanie chorób
Hybrydyzacja metodą Southerna (1975) służy do analizy fragmentów DNA (np. po cięciu enzymami restrykcyjnymi). Cięcie enzymami restrykcyjnymi daje fragmenty DNA o nieomal ciągłym rozkładzie wielkości.
Zastosowanie sond o określonej sekwencji nukleotydów pozwala wyodrębnić fragmenty DNA posiadające sekwencje komplementarne z sekwencją sondy.
izolacja całkowitego DNA
trawienie enzymem restrykcyjnym
elektroforetyczne sortowanie fragmentów
denaturacja DNA (NaOH)
przeniesienie na filtr nylonowy/nitrocelulozowy
hybrydyzacja z sondą znakowaną izotopowo (lub fluorescencyjnie)
autoradiograficzny odczyt
ASO (allele specific oligonucleotide): metoda pozwalająca na wykrywanie alleli różniących się nawet tylko jednym nukleotydem.
W zależności od użytych enzymów restrykcyjnych fragmenty restrykcyjne mają różne długości. Mapa restrykcyjna pozwala scharakteryzować odcinek DNA.
polimorfizm pojedynczych nukleotydów (SNP)
polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP)
Metoda Northern blot (1977) służy do analizy poziomu ekspresji genu poprzez określenie poziomu ilości mRNA. Podobnie jak w analizie Southerna (DNA) próbki mRNA są rozdzielane poprzez elektroforezę na żelu z agarozy, przenoszone na filtr i hybrydyzowane z sondami znakowanymi izotopowo.
Barwienie chromosomów.
Wybarwianie prążków G uzyskuje się przez traktowanie preparatów chromosomowych enzymami proteolitycznymi i barwienie barwnikiem Giemsy. Prążki ciemne odpowiadają regionom o dużej zawartości par A-T z późno replikującym DNA.Prążki jasne odpowiadają regionom o dużej zawartości par G-C z wcześnie replikującym DNA.Wzór prążków G jest unikatowy dla każdej pary homologów, co umożliwia identyfikację każdego chromosomu. Najwięcej prążków jest w profazie
Fluorescent in situ hybridization (FISH) – metoda używana do wykrywania określonych sekwencji DNA na chromosomach. Sondy fluorescencyjne o odpowiednio dobranej sekwencji nukleotydów (o długości ok. 100 kpz) hybrydyzują z DNA chromosomu w miejscach wykazujących podobieństwo sekwencji. Sondy często są fragmentami DNA, które zostały wyizolowane i oczyszczone w ramach badań nad genomem człowieka (Human Genome Project).
Mikromacierz DNA, chip DNA – płytka z naniesionymi w regularny sposób mikropolami zawierającymi różne fragmenty DNA. Każde pole wiąże przez hybrydyzację komplementarne do siebie cząsteczki DNA lub RNA. Mikromacierze dwukolorowe (dwukanałowe) służą do porównania ekspresji genów pochodzących np. z komórek normalnych i nowotworowych. Analiza względnego natężenia świecenia dwóch fluoroforów pozwala porównać poziomy ekspresji tych samych genów pochodzących z różnych próbek.
Farmakogenetyka – badanie wpływu pojedynczych genów na reakcję organizmu na podanie określonych leków. W wyniku zaburzenia działania leku może dochodzić do:
nadmiernego działania leku (przez zmniejszenie biotransformacji)
niedostatecznego lub braku działania leku (przez zwiększenie biotransformacji)
wystąpienia toksycznych lub innych działań niepożądanych
wystąpienia pewnych chorób (np. nowotworów) związanych ze stosowaniem leku
Sukcynylocholina – środek zwiotczający mięśnie, agonista acetylocholiny blokujący przewodzenie nerwowo-mięśniowe. Stosowana przy intubacji.
Działanie normalne: szybki początek działania (30-45 s po podaniu), krótki czas działania (4-5 min).
Współczynnik metaboliczny (MR) pozwala w ilościowy sposób opisać metabolizm danej substancji.
Fenotypy dla debryzochiny jako substancji modelowej:
MR > 12,6 – „słabo metabolizujący” (poor metabolizer – PM)
MR < 12,6 – „szybko metabolizujący” – normalny (extensive metabolizer – EM)
MR < 0,1 – „ultraszybko metabolizujący”
MR = wydzielona substancja macierzysta/wydzielone metabolity
Cytochrom P450 – rodzina enzymów (ok. 150 genów u człowieka) działających jako monooksygenazy.
Występowanie: głównie wątroba, inne komórki oprócz mięśni poprzecznie prążkowanych i erytrocytów. Lokalizacja P450 (50-55 kDa): błona retikulum endoplazmatycznego i wewnętrzna błona mitochondrialna. Ważną funkcją cytochromów P450 jest udział w procesach metabolizmu ksenobiotyków (w tym leków). (izoenzym CYP 2D6)
CYP 2D6 katalizuje oksydację ponad 40 leków:
przeciwarytmiczne (sparteina)
b-blokery
przeciwnadciśnieniowe (debryzochina)
neuroleptyki
leki przeciwdepresyjne
pochodne morfiny (przeciwbólowe i przeciwkaszlowe – dekstrometorfan)
Transportery ABC (ATP Binding Casette transporter proteins) – białka transportowe posiadające kasetę ABC.
P-gp (p-glikoproteina, produkt genu ABCB1) – białko aktywnie transportujące leki (lub ksenobiotyki) odkomórkowo. P-gp jest obecne w błonach komórek nabłonka jelit, komórek wątroby, nerek, błonach komórek śródbłonka mózgu.
Biotechnologia – aplikacja technologii, która stosuje systemy biologiczne, żywe organizmy lub ich części, aby wytworzyć lub zmodyfikować produkty i procesy celem ich zastosowania w określonym, szczególnym kierunku.
Biotechnologia: czerwona (medyczna), zielona (rolnicza), biała (przemysłowa)
Produkcja testów diagnostycznych:
reakcja RT-PCR – detekcja bardzo małych ilości materiału genetycznego lub mutacji punktowych
Produkcja szczepionek:
użycie roślin lub bakterii do produkcji wyodrębnionych antygenów.
szczepionki doustne (zjadane z roślinami – transgeniczna sałata przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B).
Produkcja testów diagnostycznych:
sondy molekularne (jednoniciowe fragmenty DNA) znakowane biotyną do wykrywania zakażeń bakteriami lub pasożytami).
testy diagnostyczne oparte na PCR – startery/sondy fluorescencyjnie znakowane fluoresceiną lub rodaminą.
Produkcja leków:
mikroorganizmy niosące ludzkie geny insuliny, hormonu wzrostu, interferonów, czynników przeciwzakrzepowych, EGF, EPO
rośliny posiadające geny: IL-10, insuliny (ziemniaki), hormonu wzrostu (tytoń), albuminy surowicy człowieka (ziemniaki, tytoń), leku przeciw nadciśnieniu (pomidor), IFN-a (ryż, rzepa). Wszystkie na etapie prób.
transgeniczne zwierzęta produkujące terapeutyczne białka (a1-antytrypsyna), głównie w mleku
leki przeciwwirusowe – zapalenia wątroby typu C, grypy.
Podstawowe kierunki rozwoju białej biotechnologii:
przetwarzanie biomasy na biopaliwa
przetwarzanie biomasy na biodegradowalne masy plastyczne
zastąpienie tradycyjnych technologii produkcji leków, kosmetyków, chemikalii, żywności
bioremediacja (usuwanie np. metali ciężkich ze środowiska)