Pokolumnowa derywatyzacja w chromatograficznej analizie węglowodanów

streszczenie

Streszczone są różne metody przedkolumnmowej derywatyzacji węglowodanów dla detekcji fotometrycznej, fluorometrycznej i elektorchemicznej. Główne metody obejmuja konwersję węglowodanów do furfuralu( z silnymi kwasami mineralnymi w reakcji redukcji weglowodanow- w analizie fotometrycznej) do formaldehydu ( z nadjodkami- w metodzie fotometrycznej i fluorometrycznej) do glycamin (w reakcji aminowania-redukcja węglowodanów w metodzie fotometrycznej i fluorometrycznej) itd, a następnie kompensacji z odpowiednim fluoro- lub –chromo-pochodną, bezpośrednią lub pośrednią zmianą barwy z użyciem związków leuco(bezbarwne związki powstające przez redukcje barwnych związków i przyjmujące barwę po ponownym utlenieniu) (w metodzie fotometrycznej) lub z odczynnikami chelatującymi (dla fotometrycznej lub elektochemicznej) wykorzystując właściwości redukujące węglowodanów redukujących; w reakcji z alifatycznymi aminami, 2-cyjanoacetamidem, argininą, benzamidami itd, w obojętym lub lekko zasadowym środowisku i koloryzacją w reakcji kondensacji ze związkami hydrazyny w środowisku alkalicznym. Charatkerystyka poszczególnych metod i ich optymalne warunki są przedstawione.

Wstęp

Detekcja węglowodanów jest bardzo istotna dla biologów, biotechnologów oraz biochemików zajmujących się zagadnieniami metabolizmu. Ze względu na brak barwników w węglowodanach ich wykrycie za pomocą pospolitych detektorów optycznych jest trudne. Chociaż w chromatografii absorpcyjnej UV w zakresie niewielkich długości fali i współczynnik refkarcji wskaują na możliwość wykrywania węglowodanów tą metodą, to jednak czułośc i selektywnośc w tej metodzie jest niewielka. Dlatego włośono wiele wysiłku by okryć metody derywatyzacji do form, które mogą być wykrywane fotometrycznie lub fluorometrycznie.
Są dwa modele derywatyzacji w chromatografii cieczowej- przedkolumnowa i pokolumnowa. Przedkolumnowa derywatyzacja dotyczy wprowadzenia znaczników wykrywanych metodą fotometryczną lub fluoromeryczną i jest użyteczna nie tyko dla chromatografii cieczowej ale również dla elektoforezy. Natomiast w derywatyzacji pokolumnowej przeprowadza się reakcje po właściwym rozdziale ale powinno się ją przeprowadząc przed detekcją. Chromatografia cieczowa spełnia ten warunek, ponieważ pożadana reakcja w wymaganej temperaturze może być zrealizowana poprzez kontrolowanie średnicy kolumny, niski przepływ rozpuszczalników i łaźnię nadająca odpowiednią temperaturę. Z tego powodu derywatyzacja pokolumnowa stała się podobna do chromatografii cieczowej. W przeciwieństwie do tego, w elektroforezie nie ma zbyt dużo czasu na porozdziałową derywatyzację, a więc w elektroforezie derywatyzacja pokolumnowa nie jest użyteczna.

Derywatyzacja pokolumnowa przykuła uwagę analityków zajmująych się analizą węglowodanów, ponieważ wąska rurka łącząca wylot kolumny separacyjnej i komórka detektora sa traktowane jako małe naczynko reakcyjne, w którym mieszanina reakcyjna porusza się powoli ze stałą szybkością. Reagentami w tym naczynku reakcyjnym są węglowodanowe składniki próbki i reagent.

Innym aspektem pokolumnowej derywatyzacji w chromatografii cieczowej jest to, że jest ona całkowicie zautomatyzowana, co wpłynęło na powszechność stosowania derywatyzacji pokojumnowej w rutynowych analizach węglowodorów.

Wiele metod analizy węglowodorów zostało wynaleznionych. W tej prezentacji zostaną przedstawione niektóre z metod.

Konwersja do furfuralu z silnymi kwasami, z następczą reakcją kondensacji z barwnikiem

Klasyczną metoda charakteryzująca węglowodory jest oparta na obserwowanym kolorze produktu, gdy próbkę węglowodorów potraktuje się mieszaniną silnego kwasu mineralnego i odpowiedniego odczynnika barwiącego, jak fenol, 3,5-dihydroksytoluen, antchron, cysteina, karbazol, rezorcinol albo indol. W tej metodzie monosacharydy są głównie konwertowane przez dehydratację i cyklizację do pochodnych furfuralu, które są jednocześnie kondensowane z odczynnikiem barwiącym. Niektóre z tych metod są ogólne dla cukrów redukujących a inne są selektywne dla poszczególnych grup węglowodorów. Poli i oligosacharydy są hydrolizowane do monosacharydów i są analizowane analogicznie do monosacharydów.

Pierwsze zastosowanie tej metody w zautomatyzowanym systemie miało miejsce w latach 60’. Użyto miesznainy mono i oligosacharydów. Rsyunek przedstawia typowy przykład separacji. W tym przykładzie, mono i oligosacharydy zostały poddane rozdziałowi na anionicie-kompleksie borowym i derywatyzowane z roztworem orcinolu w kwasie siarkowym. Zakres wykrywalności wynosił 0.1-0.2 nmol w zależności od typu węglowodoru.

Ten typ analizy był przełomowy w jakościowej analizie węglowodorów. Wymieniacz jonowy, jakim był kompleks borowy na żelu był bardzo skuteczny w stosunku do jonowych węglowodorów: kwasu uranowego, kwasu sialowego, sialooligosacharydów, neutralnych mono, poli i oligosacharydów, czyli zarówno węglowodanów redukujących jak i nieroedukujących. Niestety wadą tej metody było stosowanie silnych kwasów nieorganicznych, które jako odczynniki korodujące powodowały niszczenie aparatury. Jednak metoda ta odcisnęła historyczne piętno i nadal jest ważna a analizie węglowodanów.

Reakcje węglowodanów z różnymi rodzajami reagentów w silnych kwasach dawały nie tylko koloryzację ale również fluorescencje, na przykład rezorcynol w kwasie solnym, o-aminotiofenol w kwasie siarkowym i 5-hydrokxytetralon w kwasie siarkowym odnotowano jako dające fluorescencje i zostały użyte do fluorometrycznego analizowania węglowodanów. Niemniej jednak ten typ reakcji nie był przydatny w derywatyzacji pokolumnowej, ponieważ również wymagał użycia silnych kwasów.

Wykorzytsanie właściwości redukcyjnych węglowodorów w analizie fotometrycznej, fluorometrycznej i elektrochemicznej

Węglowodory redukujące mogą okazywać swoje właściwości z różnymi związkami. Np. niektóre jony metali jak Fe(III), Cu(II) sa redukowane do Fe(II) i Cu(I). Zatem jeśli związki zdolne do wiązania jonów na niższych stopniach utlenienia i utworzenia chelatów posiadających zdolność absorbcji w zakresie widma UV lub widzialnego zakresu światła, i niewiążące się w chelaty z jonami na wyższych stopniach utlenienia są dodawane do takiej mieszaniny, to możliwa jest fotometryczna detekcja węglowodorów redukujących.

Typowym przykładem jest metoda Cu(2+)-2,2’bicynchoninowa wynaleziona przez Moppera. W tej metodzie jako odczynnik derywatyzujący użyty był roztwór reagenta zawierającego CuSO4, 2,2’-bicyncinon i kwas asparginowy (jako odczynnik maskujący). Gdy węglowodany redukujące. Po reakcji na kolumnie wypełnionej jonowymienną żywicą w formie siarczanów w temp 100st C, nastąpiła redukcja miedzi, która połączyła się z 2,2’bicynchinonem i utworzyła chelat posiadający maksimum absorbcji w 562nm. Minimalne stężenie wykrywalne tą metodoą wynosiło 100pmol dla monosacharydów. Separacja na wypełeniniu z anionowym kompleksem boru była niezadawalająca, ponieważ reakcja niechętnie zachodziłą w wodnym środowisku. Niemniej jednak ostrożna optymalizacja warunków prowadziła do podobnej detencji jak w przypadku wodnego roztworu etanolu. Węglowodanymogą redukować jon ceru(IV) do ceru(III), który ma zdolności fluorescencyjne. Katz dodał tą reakcje do pokolumnowej derywatyzacji dla detekcji fluoroscencyjnej. R-r reagenta zawierał jony ceru (IV) w stężeniu 0.5mM w r-rze kwasu siarkowego 1.5M. Dodatek bizmutanu sodu w stęzniu 10-30mg/ml stabilizuje kolumnę bez wpływu ja czułość metody. Katz podał przykład fotometrycznego kontrolowania węglowodanó redukujących i nieredukujących rolzdzielanych na kolumnie anionitowej. Steżenenia węglowodanów były zazwyczaj ok 0.2 mM. Metoda ta wymagałą użycia kwasu siarkowego i selektywność nei była zbyt duza.

Kolejna metoda była zaporponowana przez Moggela i Degensa, była ona oparta na reakcji redukcji błękitu tetrazylowego w alkaicznym środowisku. Mieszanina ta zmieniała się w barwy roztwór posiadający maksimum absorbcji przy520nm, poprzez ogrzewanie z redukującym węglowodanem. Limit detekcji tą metodą wynisił 100pmol

Utlenianie nadjodanem z następczą reakcją Hantzcha prowadzącą do pochodnych pirydyny

Reakcja używana przez Hantzscha do syntezy pirydyny obejmowała trzy reagenty: aldehyd, B-diketon i B-okso ester oraz amine. Końcowa pochodna pirydyny absorbowała i wykazywała właściwości fluorescencyjne w widzialnym zakresie światła. Ponieważ ta reakcja angażuje 3 reagenty, każdy z nich może być użyty jako czynnik determinujący by zoptymalizować reakcję. Wpływ formaldehydu został bardzo dokładnie zbadany i ztabelaryzowany. Z innej strony, wiadomym jest, że utlenianie najdodanem grupy –CHOH-CH2 lub –COCH2OH w odpowiednich warunkach daje formaldehyd. Reakcja formaldehydu z 2,4-dentadionem pod wpływem amoniaku daje pochodą pirydyny, a więc może być ona użyta również w rozpozananiu węglowodanów

Pierwszy etap derywatyzacji to utlenianie nadjodanem. W klasycznym utlenianiu nadjodanem stosuje się roztwór kwasu nadjodowego. Zaletą tego reagenta jest możliwość kontrolowania procesu utleniania jednakże szybkośc reakcji nie jest zbyt duża. Utlenianie węglowodanów nadjodanem wymaga zazwyczaj jednoczesnego rozszczepienia hydrolitycznego utworzonego estru formylowego i kolejnego utleniania. Występuje to szczególnie w wysokim pH. Niemniej jednak szybkie i ilościowe powstawanie formaldehydu jest ważne w pokolumnowej derywatyzacji, ponieważ bierze on ilościowo udział w tworzeniu pirydyny, podczas gdy inne produkty utleniania nie kolidują z założoną reakcją. Z tego powodu utlenianie najdodanem powinno być prowadzone w wysokim pH z użyciem wodnego roztworu nadjodanu sodu.

Drugim etapem jest cyklizacja do pochodnej pirydyny. Pozostale reagenty mogą być dodane (B-diketon i B-oksoester oraz amoniak) ponieważ nie zmieniają się w roztworze i nie wydłużają czasu reakcji. Problemem jest nadmiar nadjodanu, który przeszkadza w reakcji cyklizacji imusi być przekształcony w pochodną, która nie będzie kolidowała z cyklizacją, np. poprzez dodanie arszeniku sodu, ktory reaguje z nadjodanem, natomiast nie reaguje z innymi reagentami. Detekcja powstałej pochodnej pirydyny jest przeprowadzana poprzez kmonitorowanie absorpcji UV o długości 410-420nm. Tą metodą można wykrywać mono i oligosacharydy. W przykładzie zaprezentowano detekcje aldoz rozdzielonych na kolumnie anionitowej i wykrytych po derywatyzacji pokolumnowej. W tym przypadku detekcja była prowadzona fotometrycznie, jednak fluorometrycznie uzyskano większą dokładnośc i czułośc.

Reakcje z reagentami fluorogenicznymi

2-cyjanoacetamid

2-cyanoacetamid tworzy związki silnie fluoryzujące i mające maksimum w 380 nm podczas ogrzewania z aldozami w słabo zasadowym srodowisku. Reakcja ta została bardzo dobrze przystosowana do derywatyzacji pokoumnowej poprzez odpowiednią optymalizacje eluenta jako środowiska reakcji. Podczas baran nad tą metodą zaobserwowano również, że produkty reakcji silnie absorbują światło przy długości fali 280nm (lampy miedziowe emitują światło o dokładnie takiej długości fali). Produkty można również wykrywać metoda amperometryczną za pomocą kombinowanej szklanej elektrody węglowej.

Mechanizm reakcji glukozy z tym reagentem jest skomplikowany. Pierwszy etap to kondensacja aldehydowej postaci glukozy z drupą metylenową w 2-cyjanoacetamidzie, w wyniku której powstaje związek 1, który jest następnie cyklizowany i dehydrowany na dwa sposoby. Jedna z dróg prowadzi do pochodne 2-pyrolidonu a druga daje pochodą 2-pirodony. W tym etapie następuje emisja fluorescencyjna.

Powyższa metoda została przystosowana do derywatyzacji pokolumnowej dla aldoz rozdzielanych na anionowym wymieniaczu jonowym z kompleksem borowym. Pomimo różnych warunków detekcji fotometrycznej i fluorometrycznej warunki reakcji derywatyzacji są takie same dla oby metod. Przykład 6 pokazyje chromatogram podczas detekcji fluorescencyjnej. W analogiczny sposów można poddać analizie kwas urynowy oraz aminocukry.

Arginina i benzamidyny

Metoda derywatyzacji pokolumnowej z argininą została opracowana przez Mikami i Ishida. mechanizm tej reakcji nie jest znany, jednak warunki sa łagodne, podobne do tych z uzyciem 2-cyjanoacetamidu. Maksima wzbudzenia i emisji przypadają na 320 i 430nm. Roztwór reagenta składa się z argininy i kwasu borowego. W temperaturze 160stC, glukoza i fruktoza dają taka samą intensywność fluorescencji, natomiast sacharoza i rafinoza dają jedynie 4% intensywności glukozy. Alditole i 2-deoksycukry dają wynik negatywny dla tej reakcji. Dla glukozy najniższa wykrywalność wynisiła 25pmol.

Amidyny są podobne strukturalnie do argininy. Benzamidyna i jej p-metoksy pochodna została wybrana dla fluorogenicznych związków i zastosowana do derywatyzacji pokolumnowej przez Kai. Metoda wykorzytujaca benzamidyne i p-metoksybenzamidyne różniła się od metowy wykorzytsującej argininę, ponieważ w tym przypadku środowisko reakcji było silnie zasadowe. Standardowa procedura obejmowała użycie 1m KOH i niskiej szybkości przepływu (0.5ml/min) w temperaturze 100stC i w kolumnie 5m. Roztwór reagenta (40mM p-metoksybenzamidyna w wodzie) była wprowadzana po KOH, ponieważ w silnie zasadowym środowisku jest ona niestabilna. W tych warunkach limit detekcji dla glukozy wynosił 15pmol

Barwienie kondensatów ze związkami hydrozynowymi

Lever odkrył, że reakcja redukcji węglowodanów z różnymi rodzajami hydrazyn kwasów aromatycznych w środowisku silnie zasadowym prowadzi do żółtego zabarwienia mieszaniny. Mechanizm tej reakcji nie został odkryty, jednakże koloryzacja jest uważana jako wynik powstania anionowej pochodnej hydrazyn węglowodanów.

Połaczenie tej reacji z derywatyzacja pokolumnową węglowodanów zostałą opisana przez Vratny’ego. Przygotował o r-r reagenta poprzez zmieszanie 10 porcji 5% roztworu hydrazyny kwasu p-hydroksybenzoesowego w 0.5M Hcl i 75 porcji 0.75M NaOH. Żółta miesznaina była podgrzana do 100stC i obserwowana przy długości fali swiatłą równej 410 nm. Ten system pozwolił na wykrycie glukozy i fruktozy rozdzielonych na fazie ligando-wymienej z taką samą czułoscia dla obu związków. Niestety węglowodany nieredukujące nie mogę być wykryte tym sposobem, jednak przepuszczanie eluatu przez kolumnę hydrolizująca wypełnioną kationitem pozwalana na wykrycie węglowodanów nieredukujacych.

Del Nozal opisał nową metodę fotometrycznej detekcji redukujących węglowodanów opartą na kondensazji z 4-amino-3-hydrazyno-5-merkapto-1,2,4-triazolem (purpald) Mechanizm reakcji jest przedstawiony na schemacie. Forma połączonego pierścienia tetrazonu i triazolu wymaga jonu hydroksylowego i oksoniowego. Miesznaina reakcyjna zawierała purpald i 0,4% nadtlenku wodoru w 2M NaOH. Pokolumnowa derywatyzacja poszczególnych aldoz rozdzielonych na kolumnie ligando-wymiennej z wodą jako eluentem w 90stC i monitorowana przy długości fali 550nm pozwoliła na wykrycie produktów z czułoscią mniejszą niż 0.1 nM.

Analiza aminocukrów i redukujących węglowodanów z użyciem aminokwasów

Aminocukry są podstawowymi węglodowanami szeroko występującymi w glikokoniungatach, zazwyczaj pod postacią oligo i polisacharydowych łańcuchów jako N-acylowane formy. Kwasowa hydroliza glikokoniungatów prowadzi do monosacharydów poprzez usunięcie grupy acylowej , odwrotnie można postępować z obojętnymi węglowodanami redukującymi, które mogę być przemienione do glicamin poprzez reakcję z solą amoniową z wodorkiem bromu (na schemacie)

Ponieważ amino cukry i glikoaminy są rodzajem alifatycznych pierwszorzędowych amin, reagują one z ninhydrynami tak samo jak aminokwasu dając fioletowe barwniki. Hara zoptymalizował warunki separacji pochodnych gikoamin z obojętnych monosacharydów poprzez chromsatografie jonowymienną przez co osiągnął jeednoczesną alanizę glukozy, galaktozy, mannozy, fukozy, ramnozy, ksylozy, arabinozy i rybozy w czasie 3 godzinnej fotometrycznej detekcji po pokolumnowej derywatyzacji z ninhydryną. Wykres kalibracyjny wykazuje charakter liniowy w zakresie 0.5-2mikromola.

Podsumowanie

Przedstawiono kilka metod rozdzialu i detekcji węglowodanów z wykoryztaniem derywatyzacji pokolumnowej. Nie jest łatwo wybrać najlepsza metodę do analizy, wybór zależy od składu próbki, można jednak zauważyć następującą tendencję dla węglowanów: detekcja elektrochemiczna jest najbardziej czuła, następnie jest detekja fluorometryczna, natomiast detekcja fotometryczna jest najmniej czuła.

Generalnie reakcje z chromogennymi odczynnikami, takimi jak fenol, orcinol i tymol w silnych kwasach mają szerokie zastosowanie do większości cukrów redukujących w tym aldozy, ketozy, oligo i polisacharydy, ale nie są odpowiednie dla nieredukujących węglowodanów. Niektóre odczynniki chromogenne, jak na przykład karbazol są odpowiednie dla odpowiednich związków, np. kwasu urynowego i sialowego, gdy reakcja przebiega w silnych kwasach. Wiele metod opartych na ogrzewaniu z fluorogenicznym reagentem (np. 2-cyjanoacetamid, arginina, beznamidyna) jest stukecznych z większością redukującuch mono i oligosacharydów, ale nie nadają się do naalizy nieredukujących węglowodanów. Takie samo ograniczenie występuje w przypadku metody opartej na koloryzacji hydrazynowych kondensatów. Metoda Hantzscha polegająca na utlenianiu nadjodanem pozwala na detekcję węglowodanów posiadających pierwszorzędową grupę –OH sąsiadującą z drugorzędową grupą hydroksylową lub grupę ketonową, co pozwala na wykrycie zarówno aldoz jak i ketoz.

Ze względów technicznych najlepszymi metodami sa takie, które nie wykorzystują silnych kwasów i zasad w procedurze analitycznej. Silne odczynniki powodują niszczenie układu i zmienjszają żywotność aparatury, dlatego też polecane są takie metody jak utlenianie nadjodanem lub reakcje z fluorogenicznymi reagentami.