Chromatografia planarna – cienkowarstwowa TLC

Faza ruchoma porusza się dzięki silom kapilarnym.

Fazy stacjonarne: żel krzemionkowy, proszek celulozowy, żywice jonowymienne, materiały o ograniczonych rozmiarach jonów, selektory chiralne.

Fazy ruchome: rozpuszczalniki o różnej porowatości i ich mieszaniny.

Detekcja w TLC – mineralizacja chemiczna

- spryskiwanie płytki odczynnikiem chromogennym, np. kwasem fosforomolibdenowym, ninhydryną (aminokwasy i aminy), rodamina (lipidy),

- oglądanie płytki w świetle UV,

- spryskiwanie płytki stężonym kwasem siarkowym, azotowym co powoduje zwęglanie matrycy organicznej,

- densytometryczne – pomiar promieniowania odbitego od powierzchni.

Zastosowanie TLC:

- rozdzielanie związków organicznych

*analiza jakościowa próbek biochemicznych,

*farmaceutycznych (steroidy)

*klinicznych,

*analiza sądowa (narkotyki),

- do sprawdzania czystości związków,

- w procesach produkcyjnych do monitorowania przebiegu reakcji.

Schemat chromatografu HPLC

Układ pobierania rozpuszczalników → układ mieszania rozpuszczalników → pompa (strzykawkowa, tłokowa) → degazer (do odgazowywania próbek, aby nie powstawały pęcherzyki powietrza, odparowywanie ultradźwiękami, odgazowywanie przez membranę) → autosampler (pobiera i wstrzykuje próbkę na kolumnę; od 10 µl do 100-200 µl) → prekolumna (krótsza od kolumny, 10 – 15 cm, służy do wstępnego oczyszczania próbki → kolumna → detektor → system zbierania danych.

Elucja

- izokratyczna – od początku do końca procesu chromatograficznego stosuje się ten sam rozpuszczalnik,

- gradientowa – zmienia się wzajemny stosunek (objętościowy, masowy) jednego rozpuszczalnika do drugiego.

Detektory

Granice wykrywalności [ng]

UV-VIS	0,1 – 1	Gradient
Refraktometryczny	100 – 1000		Niespecyficzny, bada rozpraszanie, tani, nie wie co wykrywa
Elektrochemiczny	0,01 – 1		Może zidentyfikować co się bada
Fluorescencyjny	0,001 – 0,01	Gradient	Drogi, szeroko stosowany w analizie klinicznej, białka, lipidy
Konduktometryczny	0,5 – 1		Zmiana przewodnictwa, rejestruje zmiany, niespecyficzny
Spektrometr mas	0,1 – 1	Gradient	Jeden z najlepszych, liczy masę cząsteczki danej substancji
FTIR	1000	Gradient	Spektrometria w podczerwieni z transformacją Fouriera, specyficzny

Chromatografia podziałowa

Cieczowa – fazą stacjonarna jest ciecz utrzymywana na nośniku w wyniku adsorpcji na powierzchni cząstek wypełnienia.

Z faza powiązaną – fazą stacjonarną jest substancja organiczna chemicznie związana z powierzchnią cząstek wypełnienia – C18 powszechniej stosowane nie wymagają regeneracji, ograniczona pojemność.

Chromatografia podziałowa:

- w normalnym układzie faz – faza stacjonarna bardziej polarna niż faza ruchoma, faza ruchoma – węglowodory, alkohole lub rozpuszczalniki chlorowane,

- w odwróconym układzie faz – faza stacjonarna mniej polarna niż faza ruchoma, najczęściej stosowana faza ruchoma: bufor – metanol, woda – acetonitryl, THF.

Jakie anality będą wymywane jako pierwsze? → polarne.

Jak na szybkość wymywania wpłynie zwiększenie polarności fazy ruchomej? → znacznie przyśpieszy szybkość wymywania.

- z tworzenia par jonowych do związków dysocjujących. Wybór rozpuszczalnika na podstawie szeregu eluotropowego.

Fazy stacjonarne

- polarne fazy stacjonarne:

*SH(CH₃)₂NH₂ (aminoalkilowe, aminopropylowe)

*SH(CH₃)₂CN (cyjanoalkilowe)

*SH(CH₃)₂OCHOHCH₂OH (diolowe)

- niepolarne fazy stacjonarne

- R-(CH₂)₃CH₃ (akta decylowa, oktylowe, butylowe, etylowe)

- (CH₂)₂C₆H₁₁

Zastosowanie:

- farmaceutyki – antybiotyki, uspokajające, przeciwzapalne, stereoidy,

- biochemiczne – aminokwasy, białka,

- żywność,

- zanieczyszczenia,

- chemia kryminalistyczna,

- medycyna kliniczna.

Chromatografia adsorpcyjna

Faza stacjonarna: żel krzemionkowy, tlenek glinu,

Faza ruchoma: rozpuszczalnik organiczny lub mieszanina rozpuszczalników

Adsorpcja powierzchniowa na grupach silanolowych –Si-OH, wymywanie w kolejności wzrastającej polarności.

Zastosowanie:

Tabela: Adsorbenty stosowane w chromatografii kolumnowej oraz przykłady ich zastosowania.

Tabela: Rozpuszczalniki uszeregowane zgodnie z wzrastającą mocą elucyjną w chromatografii adsorpcyjnej na żelu krzemionkowym.

Chromatografia żelowa

Rozdział: wypełnienie polimeryczne (pory o różnej średnicy). Cząsteczki które są za małe lub za duże przechodzą przez pory, a inne są zatrzymywane. Wybiera się odpowiedni bufor do kolumny. Na samym końcu wychodzą te, które są zatrzymywane najdłużej.

Faza stacjonarna – porowaty żel o określonej wielkości porów hydrofilowy lub hydrofobowy.

Faza ruchoma – ciecz lub gaz, brak oddziaływań miedzy faza stałą a analitem.

Zastosowanie:

- cukry, białka, szybkie oznaczanie masy cząsteczkowej lub rozkładu mas cząsteczkowych polimerów, produktów naturalnych.

W porach zatrzymywane są jedynie małe cząsteczki analitu, duże cząsteczki są wykluczane.

Chromatografia powinowactwa

Faza stacjonarna: agarowa porowate kulki szklane z unieruchomionym ligandem powinowactwa.

- ligandy, przeciwciała, inhibitory enzymów,

- elucja po zmianie warunków fazy ruchomej,

- funkcje fazy ruchomej,

- wysoka specyficzność.

Chromatografia jonowymienna

Faza stacjonarna: zwykle żywica zawierająca związane kowalencyjnie grupy funkcyjne, anionowe (np. HSO^-) lub kationowe (np. –N(CH₃)₃⁺)

Faza ruchoma: ciecz lub gaz.

Oddziaływanie elektrostatyczne między fazą stałą a analitem.

Budowa jonitu

- zbudowane z polimeru, który stanowi rdzeń wypełnienia cząsteczki, na nim znajdują się grupy funkcyjne odpowiedzialne za rozdzielanie kationowymienne (aminy III-rzędowe), anionowymienne.

Tabela: rodzaje jonitów.

Anionity:

- silnie zasadowe,

- średnio i słabo zasadowe,

Kationity:

- silnie kwasowe –SO₃^-

- średnio kwasowe –PO₃^-

- słano kwasowe –COO-

- bardzo słabo kwasowe –OH

Amfoteryczne

Chromatografia jonowa

- wysokosprawna chromatografia jonowa IC

- wysokosprawna chromatografia wykluczania jonowego HPICE

- chromatografia par jonowych MPIC

Aparatura

Dozowanie → pompa → zawór wstrzykowy → prekolumna → kolumna → degazer → supresor (dodatkowy element) → detektor → monitor

Wzrost powinowactwa

- ze wzrostem wartościowości, np. (3+) silniej zatrzymywany niż (1+)

- ze wzrostem promienia jonowego, np. Ca (większy) silniej zatrzymywany niż Mg (mniejszy)

- ze wzrostem stopnia jonizacji

Supresor

- podwyższa czułość oznaczeń

- poprawia wykrywalność

- wydłuża czas analizy, gdyż wymaga regeneracji

- oddziela wstępnie nadmiar kationów 1 wartościowych lub anionów biogennych aby nie przeszkadzały na chromatografie.

Normy IC w analizie wody i ścieków.

Zalety chromatografii jonowej:

- możliwość jednoczesnego oznaczania kilkunastu jonów

- wykrywalność µg/l

- tania

- małe zużycie rozpuszczalnika

Przygotowanie próbek do analizy, gdy konieczne jest wzbogacanie.

Przygotowanie próbek gazowych

- absorpcja w r-rach HF, HCl, NO_x,

- adsorpcja w wodzie z CO₃^2-, o,1 M NaOH.

Przygotowanie próbek ciekłych

- filtracja,

- SPE do usuwania jonów Cl^-, SO₃^2-, metali

- deprywatyzacja analitów

- techniki membranowe

- zmiana pH

Chromatografia

Jonowa	Jonowymienna
Słabe eluenty mmol/l	Silne eluenty mol/l
Oznaczanie mieszanin	Analiza pojedynczych składników
Jonity o małej pojemności wymiennej	Jonity o dużej pojemności wymiennej
Kolumna supresyjna
Duża szybkość analizy	Niewielka szybkość analizy
Różne metody detekcji	Detekcja konduktometryczna
Granica wykrywalności µg/l	Granica wykrywalności mg/l

Jak wybrać odpowiednią techniką?

- lotne, stałe techniczne

- małe masy cząsteczkowe

- tani sprzęt

- nielotne (chromatografia cieczowa)

- specyficzne (chromatografia powinowactwa)

- rozpuszczalne (zależy w czym)

*hydrofobowe

**rozmiar (żelowa)

**grupy funkcyjne (chromatografia adsorpcyjna)

**polarność (podziałowa w normalnym układzie faz)

*hydrofilowe

**rozmiar (wykluczania, żelowa)

**polarność (podziałowa, odwrócony układ faz)

- po dodaniu odpowiednich odczynników (odwrócony układ faz)