1

Agata Błaszczyk

*

Derywatyzacja
pokolumnowa w analizie
węglowodanów

2

*

Detekcja węglowodanów jest bardzo

istotna dla biologów, biotechnologów oraz
biochemików zajmujących się
zagadnieniami metabolizmu. Ze względu
na brak barwników w węglowodanach ich
wykrycie za pomocą pospolitych
detektorów optycznych jest trudne.
Chociaż w chromatografii absorpcyjnej UV
w zakresie niewielkich długości fali
współczynniki refkarcji wskazują na
możliwość wykrywania węglowodanów tą
metodą, to jednak czułość i selektywność w
tej metodzie jest niewielka. Dlatego
włożono wiele wysiłku by okryć metody
derywatyzacji do form, które mogą być
wykrywane fotometrycznie lub
fluorometrycznie.

3

Są dwa modele derywatyzacji w
chromatografii cieczowej

*

przedkolumnowa - dotyczy

wprowadzenia znaczników wykrywanych
metodą fotometryczną lub
fluoromeryczną przed wprowadzeniem
próbki na kolumnę

*

Pokolumnowa - przeprowadza się reakcje

po właściwym rozdziale natomiast przed
detekcją.

Pożądana reakcja w wymaganej
temperaturze może być zrealizowana
poprzez kontrolowanie średnicy kolumny,
niski przepływ rozpuszczalników i łaźnię
nadająca odpowiednią temperaturę

4

Derywatyzacja pokolumnowa przykuła
uwagę analityków zajmujących się analizą
węglowodanów, ponieważ wąska rurka
łącząca wylot kolumny separacyjnej i
komórka detektora są traktowane jako małe
naczynko reakcyjne, w którym mieszanina
reakcyjna porusza się powoli ze stałą
szybkością. Warunki reakcji można
kontrolować a reagentami w tym naczynku
reakcyjnym są węglowodanowe składniki
próbki i odczynnik derywatyzujący. Inną
zaletą pokolumnowej derywatyzacji jest to,
że jest ona całkowicie zautomatyzowana, co
wpłynęło na powszechność stosowania
derywatyzacji pokojumnowej w rutynowych
analizach węglowodorów.

5

*

Metody analizy

6

*

Konwersja do furfuralu z silnymi
kwasami, z następczą reakcją
kondensacji z barwnikiem

7

Klasyczna metoda charakteryzująca węglowodory jest
oparta na obserwowanym kolorze produktu, gdy
próbkę węglowodorów potraktuje się mieszaniną
silnego kwasu mineralnego i odpowiedniego
odczynnika barwiącego, jak fenol, 3,5-
dihydroksytoluen, antchron, cysteina, karbazol,
rezorcinol albo indol. W tej metodzie monosacharydy
są głównie konwertowane przez dehydratację i
cyklizację do pochodnych furfuralu, które są
jednocześnie kondensowane z odczynnikiem
barwiącym. Niektóre z tych metod są ogólne dla
cukrów redukujących a inne są selektywne dla
poszczególnych grup węglowodorów. Poli i
oligosacharydy są hydrolizowane do monosacharydów
i są analizowane analogicznie do monosacharydów.

8

Pierwsze zastosowanie tej metody w zautomatyzowanym

systemie miało miejsce w latach 60’. Użyto mieszaniny

mono i oligosacharydów.

9

Ten typ analizy był przełomowy w
jakościowej analizie węglowodorów.
Wymieniacz jonowy, jakim był kompleks
borowy na żelu był bardzo skuteczny w
stosunku do jonowych węglowodorów:
kwasu uranowego, kwasu sialowego,
sialooligosacharydów, neutralnych mono,
poli i oligosacharydów, czyli zarówno
węglowodanów redukujących jak i
nieredukujących.

10

Reakcje węglowodanów z różnymi rodzajami
reagentów w silnych kwasach dawały nie tylko
koloryzację ale również fluorescencje, na
przykład z reakcji z takimi odczynnikami jak:
rezorcynol w kwasie solnym, o-aminotiofenol w
kwasie siarkowym i 5-hydroksytetralon w
kwasie siarkowym. Zostały one użyte do
fluorescencyjnego analizowania węglowodanów.

11

*

Wykorzytsanie
właściwości redukcyjnych
węglowodorów w
analizie fotometrycznej,
fluorometrycznej i
elektrochemicznej

12

Węglowodory redukujące mogą okazywać
swoje właściwości z różnymi związkami. Np.
niektóre jony metali jak Fe(III), Cu(II) są
redukowane do Fe(II) i Cu(I). Detekcja
oparta jest na możliwości łaczenia się
węglowodorów ze zredukowanymi jonami
metali w chelaty, które wykazują absorbcję
swiatła.

13

*

metoda Moppera z

Cu

(2+)

-2,2’bicynchoninonem

W tej metodzie jako odczynnik derywatyzujący
użyty był roztwór reagenta zawierającego
CuSO4, 2,2’-bicyncinon i kwas asparginowy
(jako odczynnik maskujący). Po rozdziale na
kolumnie wypełnionej jonowymienną żywicą w
formie siarczanów w temp 100st C, nastąpiła
redukcja miedzi, która połączyła się z
2,2’bicynchinonem i utworzyła chelat
posiadający maksimum absorbcji w 562nm.
Minimalne stężenie wykrywalne tą metododą
wynosiło 100pmol dla monosacharydów.

14

*

Separacja na wypełeniniu z anionowym

kompleksem boru była niezadawalająca, ponieważ
reakcja niechętnie zachodziła w wodnym
środowisku. Niemniej jednak ostrożna
optymalizacja warunków prowadziła do podobnej
detencji jak w przypadku wodnego roztworu
etanolu.

15

*

Metoda Katza

Węglowodany mogą redukować jon ceru(IV) do
ceru(III), który ma zdolności fluorescencyjne.
Katz dodał tą reakcje do pokolumnowej
derywatyzacji dla detekcji fluoroscencyjnej. R-r
reagenta zawierał jony ceru (IV) w stężeniu
0.5mM w r-rze kwasu siarkowego 1.5M.
Dodatek bizmutanu sodu w stężniu 10-30mg/ml
stabilizuje kolumnę bez wpływu ja czułość
metody. Katz podał przykład fotometrycznego
analizowania węglowodanów redukujących i
nieredukujących rozdzielanych na kolumnie
anionitowej. Metoda ta wymagała użycia kwasu
siarkowego a selektywność nie była zbyt duża.

16

*

Metoda Moggela i

Degensa

Oparta na reakcji redukcji błękitu
tetrazylowego w alkaicznym środowisku.
Mieszanina ta poprzez ogrzewanie z
redukującym węglowodanem zmieniała się w
barwy roztwór posiadający maksimum
absorbcji przy 520nm. Limit detekcji tą metodą
wynosił 100pmol węglowodanu.

17

*

Utlenianie nadjodanem
z następczą reakcją
Hantzcha prowadzącą do
pochodnych pirydyny

18

Reakcja używana przez Hantzscha do
syntezy pirydyny obejmowała trzy reagenty:
aldehyd, B-diketon i B-oksoester oraz aminę.
Końcowa pochodna pirydyny absorbowała i
wykazywała właściwości fluorescencyjne w
widzialnym zakresie światła. Ponieważ ta
reakcja angażuje 3 reagenty, każdy z nich
może być użyty jako czynnik determinujący
by zoptymalizować reakcję. Reakcja
formaldehydu z 2,4-pentadionem pod
wpływem amoniaku daje pochodną pirydyny,
a więc może być ona użyta również w
rozpoznaniu węglowodanów

19

Detekcja powstałej pochodnej pirydyny jest
przeprowadzana poprzez obserwowanie absorpcji UV o
długości 410-420nm. Tą metodą można wykrywać mono i
oligosacharydy. W przykładzie zaprezentowano detekcje
aldoz rozdzielonych na kolumnie anionitowej i wykrytych
po derywatyzacji pokolumnowej. W tym przypadku
detekcja była prowadzona fotometrycznie, jednak
fluorometrycznie uzyskano większą dokładność i czułość.

20

*

Reakcje z
reagentami
fluorogenicznymi

21

*

2-cyjanoacetamid

2-cyanoacetamid tworzy związki silnie
fluoryzujące i mające maksimum w 380 nm
podczas ogrzewania z aldozami w słabo
zasadowym środowisku. Podczas badań nad tą
metodą zaobserwowano również, że produkty
reakcji silnie absorbują światło przy długości fali
280nm (lampy miedziowe emitują światło o
dokładnie takiej długości fali). Produkty można
również wykrywać metoda amperometryczną za
pomocą kombinowanej szklanej elektrody
węglowej.

22

23

Powyższa metoda została przystosowana do
derywatyzacji pokolumnowej dla aldoz
rozdzielanych na anionowym wymieniaczu
jonowym z kompleksem borowym. Pomimo
różnych warunków detekcji

fotometrycznej

i

fluorometrycznej warunki reakcji derywatyzacji
są takie same dla obu metod.

24

*

Arginina i benzamidyny

Metoda derywatyzacji pokolumnowej z argininą
została opracowana przez Mikami i Ishida.
mechanizm tej reakcji nie jest znany, jednak
warunki są łagodne, podobne do tych z użyciem
2-cyjanoacetamidu. Maksima wzbudzenia i emisji
przypadają na 320 i 430nm. Roztwór reagenta
składa się z argininy i kwasu borowego. W
temperaturze 160stC, glukoza i fruktoza dają
taka samą intensywność fluorescencji, natomiast
sacharoza i rafinoza dają jedynie 4%
intensywności glukozy. Alditole i 2-deoksycukry
dają wynik negatywny dla tej reakcji. Dla glukozy
najniższa wykrywalność wynosiła 25pmol.

25

Amidyny są podobne strukturalnie do
argininy. Metoda wykorzytująca
benzamidyne i p-metoksybenzamidyne
różniła się od metody wykorzystującej
argininę, ponieważ w tym przypadku
środowisko reakcji było silnie zasadowe.
Standardowa procedura obejmowała użycie
1M KOH i niskiej szybkości przepływu
(0.5ml/min) w temperaturze 100stC i w
kolumnie 5m. Roztwór reagenta (40mM p-
metoksybenzamidyna w wodzie) był
wprowadzany po KOH, ponieważ w silnie
zasadowym środowisku jest on niestabilny. W
tych warunkach limit detekcji dla glukozy
wynosił 15pmol

26

*

Barwienie kondensatów ze
związkami hydrozynowymi

27

Lever odkrył, że reakcja redukcji
węglowodanów z różnymi rodzajami
hydrazyn kwasów aromatycznych w
środowisku silnie zasadowym prowadzi do
żółtego zabarwienia mieszaniny.
Mechanizm tej reakcji nie został odkryty,
jednakże koloryzacja jest uważana jako
wynik powstania anionowej pochodnej
hydrazyn węglowodanów.

28

Połączenie tej reakcji z derywatyzacja
pokolumnową węglowodanów została opisana
przez Vratny’ego. Przygotował on r-r reagenta
poprzez zmieszanie 10 porcji 5% roztworu
hydrazyny kwasu p-hydroksybenzoesowego w
0.5M HCl i 75 porcji 0.75M NaOH. Żółta
mieszanina była podgrzana do 100stC i
obserwowana przy długości fali światła równej
410 nm. Ten system pozwolił na wykrycie
glukozy i fruktozy rozdzielonych na fazie
ligando-wymiennej z taką samą czułością dla
obu związków. Niestety węglowodany
nieredukujące nie mogą być wykryte tym
sposobem, jednak przepuszczanie eluatu przez
kolumnę hydrolizująca wypełnioną kationitem
pozwalana na wykrycie węglowodanów
nieredukujących

29

Del Nozal opisał nową metodę fotometrycznej
detekcji redukujących węglowodanów opartą na
kondensacji z 4-amino-3-hydrazyno-5-merkapto-
1,2,4-triazolem (purpald) Forma połączonego
pierścienia tetrazonu i triazolu wymaga jonu
hydroksylowego i oksoniowego. Mieszanina
reakcyjna zawierała purpald i 0,4% nadtlenku
wodoru w 2M NaOH. Pokolumnowa derywatyzacja
poszczególnych aldoz rozdzielonych na kolumnie
ligando-wymiennej z wodą jako eluentem w 90stC i
monitorowana przy długości fali 550nm pozwoliła na
wykrycie produktów z czułością mniejszą niż 0.1 nM.

30

*

Analiza aminocukrów i
redukujących
węglowodanów z
użyciem aminokwasów

31

Aminocukry są podstawowymi węglodowanami
szeroko występującymi w glikokoniungatach,
zazwyczaj pod postacią oligo i polisacharydowych
łańcuchów jako N-acylowane formy. Kwasowa
hydroliza glikokoniungatów prowadzi do
monosacharydów poprzez usunięcie grupy acylowej,
odwrotnie można postępować z obojętnymi
węglowodanami redukującymi, które mogą być
przemienione do glikamin poprzez reakcję z solą
amoniową z wodorkiem bromu (na schemacie)

32

Ponieważ aminocukry i glikoaminy są
rodzajem alifatycznych pierwszorzędowych
amin, reagują one z ninhydrynami tak samo
jak aminokwasy dając fioletowe barwniki.
Hara zoptymalizował warunki separacji
pochodnych gikoamin z obojętnych
monosacharydów poprzez chromatografie
jonowymienną, przez co osiągnął
jednoczesną analizę glukozy, galaktozy,
mannozy, fukozy, ramnozy, ksylozy, arabinozy
i rybozy w czasie 3 godzinnej fotometrycznej
detekcji po pokolumnowej derywatyzacji z
ninhydryną.

33

*

Podsumowanie

34

Generalnie reakcje z chromogennymi odczynnikami, takimi
jak fenol, orcinol i tymol w silnych kwasach mają szerokie
zastosowanie do większości cukrów redukujących w tym aldoz,
ketoz, oligo i polisacharydów, ale nie są odpowiednie dla
nieredukujących węglowodanów.
Niektóre odczynniki chromogenne, jak na przykład karbazol
są odpowiednie dla np. kwasu urynowego i sialowego, gdy
reakcja przebiega w silnych kwasach.
Wiele metod opartych na ogrzewaniu z fluorogenicznym
reagentem (np. 2-cyjanoacetamid, arginina, beznamidyna) jest
skutecznych z większością redukujących mono i
oligosacharydów, ale nie nadają się do analizy
nieredukujących węglowodanów.
Takie samo ograniczenie występuje w przypadku metody
opartej na barwieniu hydrazynowych kondensatów.
Metoda Hantzscha polegająca na utlenianiu nadjodanem
pozwala na detekcję węglowodanów posiadających
pierwszorzędową grupę –OH sąsiadującą z drugorzędową
grupą hydroksylową lub grupę ketonową, co pozwala na
wykrycie zarówno aldoz jak i ketoz.

35

Ze względów technicznych najlepszymi
metodami są takie, które nie
wykorzystują silnych kwasów i zasad w
procedurze analitycznej.
Silne odczynniki powodują niszczenie
układu i zmniejszają żywotność
aparatury, dlatego też polecane są
takie metody jak utlenianie
nadjodanem lub reakcje z
fluorogenicznymi reagentami.

36