12. 01. 2013 19.01.2012

Rozdzielanie organelli komórkowych

• Wirowanie frakcjonujące z różna prędkością (różnicowe) – wirowanie ze wzrastającym przyspieszeniem; wirowanie to wykonuje się każdorazowo zlewając supernatant (roztwór znad osadu) i wirując powtórnie, aż do uzyskania oczekiwanej frakcji,

• Wirowanie w gradiencie stężeń – w procesie wirowania następuje migracja cząsteczek w gradiencie stężenia roztworu, gdy ich molekularna gęstość jest zrównoważona gęstością separującego roztworu dana grupa molekuł zajmuje zwarte określone miejsce (struktury komórkowe opadają do momentu, gdy gęstość soli lub cukru zrówna się z ich gęstością)

Metoda sedymentacji Svedberga s-jednostka Svedberga, zależna od kształtu i rozmiaru cząsteczki oznacza współczynnik sedymentacji podczas ultra wirowania (optymalna temperatura 4^oC).

CYTOCHEMIA- badanie składu chemicznego oraz procesów chemicznych zachodzących w poszczególnych organellach komórkowych oraz w komórce.

• Histochemia - nauka z pogranicza histologii i biochemii. Bada skład chemiczny i procesy biochemiczne w obrębie tkanek, stosując metody nieuszkadzające struktury badanego obiektu
  Celem histochemii jest identyfikacja i lokalizacja poszczególnych substancji chemicznych, także enzymów, w tkankach i komórkach, umożliwia śledzenie badanych reakcji dokładnie w miejscu ich powstania

Precyzyjne oznaczanie w tkankach:
*białka
*kwasy nukleinowe
*enzymy
*węglowodany

Immunochistochemia – wykrywanie różnych antygenów w preparatach mikroskopowych przy zastosowaniu przeciwciał skierowanych przeciwko poszukiwanym składnikom preparatu

Histologia- nauka badająca czynności, rozwój i budowę tkanek.

Podstawy reakcji histochemicznych :

• Reakcje histochemiczne cechuje specyficzność – swoistość.

• Oddziaływanie pomiędzy wykrywana substancja (obecną w materiale biologicznym a związkami chemicznymi (wprowadzonymi do środowiska reakcji chemicznej)
  Prowadzi to do powstania produktu reakcji chemicznej (w miejscu występowania wykrywanej substancji)
  Ilośc powstającego produktu jak i jego lokalizacja wykrywane SA w obrazie mikroskopowym

Wykrywana substancja chemiczna odpowiedni związek

PRODUKT REAKCJI CHEMICZNEJ

Produkt reakcji chemicznej mysi spełniać dwa podstawowe warunki:

• Musi być widoczny w obrazie mikroskopowym

• Powinien być nierozpuszczalny w środowisku reakcji

• Wykrywana substancja nie może się przemieszczać podczas trwania reakcji chemicznej

Końcowa ocena reakcji histochemicznych odbywa się przy użyciu wszystkich typów mikroskopów świetlnych i elektronowych.

Typy reakcji histochemicznych:

• Reakcja bezpośrednia – wykrywana substancja reaguje z odpowiednim substratem, prowadzi to do powstania barwnego produktu w miejscu lokalizacji danej substancji, np. uwidacznia reszty tyrozynowe białek

• Reakcja specyficznego wiązania niektórych barwników przez określone związki wysokocząsteczkowe, np. wykrywanie DNA zielenią metylową

• Selektywna rozpuszczalność niektórych barwników – identyfikacja lipidów Sudanem III

• Reakcja specyficzna wykrywania enzymów – produktów reakcji tych enzymów

• Reakcja dwu- lub kilkuetapowa – wykrywanie wielocukrów, w podwójnej reakcji:
  *reakcja utleniania wielocukrów, zmiana struktury wykrywanej substancji
  *reakcja barwna, identyfikację interesującego nas związku chemicznego

Podstawy reakcji histochemicznych:
W tkankach lub komórkach w celu identyfikacji różnego rodzaju substancji, prowadzi się następujące reakcje histochemiczne:

• Reakcje identyfikacji węglowodanów,

• Reakcje identyfikacji lipidów

• Reakcje identyfikacji aminokwasów i białek

• Reakcje identyfikacji enzymów (fosfataz, esteraz, dehydrogenaz, peptydaz)

• Reakcje identyfikacji kwasów nukleinowych,

• Reakcje identyfikacji wielu innych substancji (aldehydy, ketony, metaloproteiny, jony – Fe, Cd)

Identyfikacja enzymów

• w zawiesinie komórkowej lub hodowli można dokonać identyfikacji komórek stosując testy na obecność enzymów specyficznych dla danych komórek, np. dehydrogenaz, reduktaz czy oksydaz

• histochemiczne wykrywanie enzymów nie polega na identyfikacji ich jako konkretnych substancji (umożliwia to zastosowanie techniki immunohistochemicznej) lecz na uwidocznieniu produktu ich aktywności (wykrywany jest produkt reakcji histochemicznej)

• wykrywany enzym musi być aktywny i musza być zastosowane odpowiednie procedury przygotowania materiału.
  * barwienie tkanki bezpośrednio po pobraniu
  *zaniechanie metod utrwalania materiału

• reakcja histochemiczna pozwalająca na wykrycie aktywności enzymu to INKUBACJA , środowisko reakcji to PŁYN INKUBACYJNY (pH, temperatura optymalna dla działania enzymu):
  *zawiera specyficzny dla wykrywanego enzymu substrat
  *jony stymulujące aktywność danego enzymu
  *dodatkowe składniki biorące udział w reakcji – koenzymy

1. Identyfikacja hydrolaz, poprzez reakcje charakterystyczne:

• Reakcja precypitacji z kationami metali – reakcja Gomoriego – pod wpływem enzymu obecnego w tkance dochodzi do hydrolizy substratu, a następnie wytrącenia produktu (jonami metali Cu²⁺ Pb²⁺). Tworzy się nierozpuszczalna sól widoczna w mikroskopie elektronowym, do celów mikroskopii świetlnej należy przeprowadzić dodatkowo reakcje barwną

• Reakcja sprzęgania dla związków azotowych – pod wpływem obecnego w tkance enzymu dochodzi do hydrolizy substratu (zazwyczaj jest to pochodna naftolu). Dochodzi do przekształcenia pochodnej naftolu w barwny i nierozpuszczalny produkt

• Reakcja indygogenna – pod wpływem obecnego w tkance enzymu dochodzi do hydrolizy substratu (zazwyczaj jest to pochodna indoksylu). Dochodzi do utleniania substratu, produkt reakcji ma zabarwienie indygo.

Przykłady barwienia hydrolaz

• ATPaza- enzym katalizujący hydrolizę wiązania wysokoenergetycznego w ATP, występuje m.in. w siateczce śródplazmatycznej komórek mięśni szkieletowych i wewnętrznej błonie mitochondrialnej
  Obserwowany produkt końcowy – brązowo-czarny siarczek kobaltu, który jest końcowym produktem reakcji. Intensywność zabarwienia zależy od stopnia aktywności ATPazy i jest mierzalna fotometrycznie

• Kwaśna fosfataza – występuje w dużych stężeniach w gruczole krokowym człowieka – hydroliza różnych estrów fosforowych.
  Aktywność jej bardzo wzrasta w chorobie nowotworowej tego gruczołu, co wykorzystuje się w diagnostyce do wczesnego rozpoznawania tej postaci raka.
  Obserwujemy wytrącający się siarczek ołowiu – zmiana jonów wapnia na ołów ze względu na kwaśne pH

Identyfikacja dehydrogenaz

• Reakcje z udziałem soli tetrazolowych – identyfikacja dehydrogenazy mleczanowej i bursztynianowej.
  
  Sole tetrazolowe w postaci utlenionej są bezbarwne lub żółte i rozpuszczalne w wodzie, w formie zredukowanej przekształcają się w for mazany, produkty reakcji histochemicznej (barwne i nierozpuszczalne). Płyn inkubacyjny – zawiera swoisty substrat (np. mleczan lub bursztynian sodu), koenzymy, sól tetrazolową.
  Wyniki: w miejscu aktywności dehydrogenazy – niebiesko-purpurowe zabarwienie. Intensywność zabarwienia i lokalizacja SA wskaźnikiem aktywności mitochondriów i ich umiejscowienia w tkance.

Kwas mlekowy kwas pirogronowy

NAD⁺ NADH+H⁺

Formazan