zasada	zastosowanie	metoda w skrócie		kontrola
Odczyn precypitacji pierścieniowej	Opiera się na reakcji precypitacji, czyli na reakcji wiązania się antygenu ze swoistymi przeciwciałami in vitro	- klasyfikacja bakterii (mikrobiologia) - medycyna sądowa (określanie pochodzenia plam z krwi i innych płynów ustrojowych) - przemysł spożywczy (wykazanie obecności obcych białek w fałszowanych prod spożywczych)	- przebieg dwuetapowy - kompleks: precypitat -strefa ekwiwalencji (strąt) - surowica, nawarstwiamy roztwór w którym poszukujemy antygenu - po kilku minutach widoczny pierścień	- warunki In vitro - precypityny, antygeny (precypitynogeny) - inaktywacja układu dopełniacza - metoda jakościowa, środowisko płynne	Wykonywana równolegle, do probówek dodaje się surowicę odpornościową i nawarstwia 0,15 molowy roztwór NaCl.
Odczyn flokulacyjny (test kłacz kujący, VDRL)	Zasadą tego odczynu jest reakcja przeciwciał obecnych w surowicy chorego z antygenem kardiolipinowym (dwufosfatydyloglicerol otrzymywany z mięśnia wołu)	- w diagnostyce kiły (znalezienie przeciwciał przeciwko Treponema pallidum)	- zinaktywowana surowica chorego na szkiełko + antygen kardiolopinowy - inaktywacja surowicy chorego! - szkiełko Lindnera z łezką - wstrząsamy, po 4 minutach odczytujemy wynik pod mikroskopem	- metoda jakościowa, środowisko płynne - wyniki: dodatni (kłaczki), słabo dodatni (mało kłaczków), ujemny (brak kłaczków)	Próby kontrolne z zastosowaniem surowic ludzkich: - dodatnie (zawierające przeciwciała przeciwko antygenowi kardiolipinowemu) - ujemne nie zawierające tych przeciwciał
Pojedyncza immunodyfuzja płytkowa, radialna (odczyn precypitacji w środowisku stałym) Wg Mancieniego !!!	Zasada opiera się na reakcji dyfuzji rozpuszczalnego antygenu i przeciwciała w żelu	- ocena stężenia białek (w surowicy i innych płynach) - poziom immunoglobulin (M, G i podklas, E) - stężenie składowych dopełniacza w surowicy krwi	- przeciwciała o danej swoistości o odpowiednio dobranym stężeniu miesza się z agarem i wylewa na płytkę - wycina się studzienki - studzienki wypełnia się antygenem (r-ór badanego białka) - tworzą się kompleksy immunologiczne, w strefie ekwiwalencji nierozpuszczalne, pierścieniowe strefy ekwiwalencji - stężenie białek w Bad materiale wylicza się na podstawie krzywej kalibracyjnej z białkami standardowymi o znanym stężeniu - średnica pierścieni jest wprost proporcjonalna do stężenia antygenu!	- pozwalają badać wiele układów A-P jednocześnie - środowisko stałe - w strefie ekwiwalencji – precypitaty w kształcie łuków/linii - odczyny immunodyfuzji: pojedyncza i podwójna (oba reagenty dyfundują) - krzywa kalibracyjna: do innych studzienek nanosimy antygeny o znanym stężeniu, wyznaczamy wykres, na podstawie średnicy możemy znaleźć antygen.
Immunoelektroforeza wg. Scheidegera	Łączy dwie techniki: elektroforezę w żelu oraz podwójną immunodyfuzję	- skład białek w surowicy ludzkiej - niedobory odpornościowe - nadprodukcja białek (gammapatie) - wykrywanie białek Bence-Jonesa w moczu u chorych na szpiczaka mnogiego	- szkiełko przedmiotowe pokryte żelem agarowym - studzienki badany materiał - elektroforeza (rozdział elektroforetyczny) - do wyciętego rowka dodaje się surowicę odpornościową inaktywowaną(immunodyfuzja) - komora wilgotna 24-48h - ocenia się powstałe łuki precypitacyjne porównując je z obrazami wzorcowymi	- dwa etapy: 1 elektroforeza, 2 immunodyfuzja podwójna Ocena: kształt, położenie, grubość łuków i ilość w strefie ekwiwalencji
Western blotting !!	Połączenie techniki immunoelektroforezy z metodami immunologicznymi z zastosowaniem znaczników	- można identyfikować każdy antygen (o ile dysponujemy przeciwciałami skierowanymi przeciw niemu)	- metoda immunoenzymatyczna EIA - badany materiał poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym w obecności siarczanu dodecylu SDS - frakcje białkowe – przenosimy je na filtr nitrocelulozowy za pomocą pola elektrycznego 1-2 A. - wolne miejsca wysyca się białkiem obojętnym, - inkubacja ze specyficznymi przeciwciałami (KIEDY DODAJE SIĘ PRZECIWCIAŁA???) oto jest pytanie - kompleks A-P - dodajemy przeciwciała II rzędowe znakowane enzymem - dodajemy substrat dla enzymu (peroksydaza chrzanowa) - zmiana barwy - wynik stężenie barwy
Aglutynacja czynna (bezpośrednia): met. szkiełkowa	Opiera się na reakcji aglutynacji, czyli zlepiania się elementów upostaciowanych pod wpływem swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom znajdującym się na ich powierzchni.	- metoda jakościowa - identyfikacja antygenów za pomocą surowic odpornościowych - diagnostyka mikrobiologiczna (identyfikacja szczepu bakteryjnego) - oznaczanie grup krwi w układzie AB0 – antygeny A i B w błonie erytocytów	- szkiełka - surowica - przeciwciała - na szkiełku przedmiotowym (lub z dołkiem) kroplę badanego aglutynogenu (nośnik antygenu) - dodajemy kroplę surowicy zaw swoiste przeciwciała (inaktywowana)! - wynik oceniamy makroskopowo: aglutynacja?	- aglutynogeny (elementy upostaciowane) - aglutyniny (przeciwciała) - reakcja aglutynacji przebiega dwuetapowo: 1 etap swoisty, aglutynina + aglutynogen. 2 wytracenie się agregatów (aglutynatów) - może być przeprowadzona na szkiełkach przedmiotowych, mikropłytkach z zagłębieniami, w probówkach	- kropla badanej zawiesiny aglutynogenu + kropla 0,85% NaCl
Aglutynacja czynna: metoda probówkowa	Opiera się na reakcji aglutynacji, czyli zlepiania się elementów upostaciowanych pod wpływem swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom znajdującym się na ich powierzchni.	- metoda półilościowa (określenie miana przeciwciał w danej surowicy) - diagnostyka mikrobiologiczna: 1. Widala – dur brzuszny 2. Weil Felixa – dur plamisty 3. Wrighta - bruceloza	- szereg probówek – kolejne rozcieńczenia badanej surowicy zinaktywowanej - dodajemy zawiesinę aglutynogenu (wszędzie taką samą objętość), - mieszamy, inkubujemy - wynik odczytujemy makroskopowo - stopień aglutynacji uzależniony jest od stężenia przeciwciał!!	- miano przeciwciał w badanej surowicy podaje się jako odwrotność największego rozcieńczenia surowicy przy którym zachodziła jeszcze aglutynacja - antygeny bakteryjne (antygen rzęskowy H, antygen O somatyczny, antygen powierzchniowy Vi)	- surowica + 0,15 molowy NaCl jednorodna zawiesina
Aglutynacja bierna (pośrednia): odczyn lateksowy [przeciwciała reagują z antygenem rozpuszczalnym uprzednio opłaszczonym na nośniku]	Opiera się na reakcji aglutynacji, czyli zlepiania się elementów upostaciowanych pod wpływem swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom rozpuszczalnym uprzednio opłaszczonych na nosniku	- wykrywanie w mat biologicznym obecności przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom rozpuszczalnym - test jakościowy, półilościowy - obecność czynnika reumatoidalnego RF (diagnoza reum zap stawów) - wykrywanie czynnika LE w diagnozowaniu układowego tocznia trzewnego - wykrywanie ASO w trwających i przebytych zakażeniach paciorkowcowych	- na gotowych jednorazowych podłożach kartonowych z ciemnym tłem - kropla badanej surowicy na badany kartonik i dodajemy odczynnik lateksowy (cząst lateksu opłaszczone odpowiednim antygenem) - mieszamy bagietką szklaną - oceniamy po 2 minutach - test jakościowy		- odczynnik lateksowy + surowica dodatnia (zawierająca dane przeciwciała) - odczynnik lateksowy + surowica ujemna
Aglutynacja bierna: odczyn hemaglutynacji	Opiera się na zjawisku aglutynacji erytrocytów (opłaszczonych uprzednio danym antygenem) w obecności swoistych przeciwciał (skierowanych przeciwko temu antygenowi)	Wykrywanie w danym materiale obecności przeciwciał albo miana przeciwciał	- stosujemy erytrocyty barana, albo ludzkie 0Rh- (wzorcowe) - spłaszczamy erytrocyty danym antygenem. - na płytkach z dołkami lub probówkach serologicznych - kolejne rozcieńczenia inaktywowanej surowicy - równe objętości opłaszczonych antygenem erytrocytów - inkubacja, 2h -odczytujemy wynik	- przeciwciała = hemaglutyniny - wynik: Dno równomiernie pokryte krwinkami lub osad – pierścień (dodatni); guziczek z erytr (ujemny) - miano – przeciwciał w badanej surowicy odwrotność największego rozcieńczenia, które powoduje jeszcze aglutynację	- kontrola ujemna (surowica badana + krwinki nie opłaszczone) - kontrola ujemna (rozcieńczalnik + krwinki opłaszczone) - dodatnia (surowica kontrolna dodania + krwinki opłaszczone)
Odczyn antyglobulinowy Coombsa (bezpośredni)	Wykrywanie ciał niekompletnych, to jest przeciwciał, które wiążą się z antygenami występującymi na powierzchni komórki, ale nie powodują aglutynacji erytrocytów (wykrywanie za pomocą przeciwciał antyglobulinowych – przeciwko gammaglobulinie ludzkiej)	- wykrycie przeciwciał niekompletnych opłaszczonych In vivo na erytrocytach - diagnostyka anemii hemolitycznej noworodków - diagnostyka niedokrwistości autoimunohemolitycznych	- na szkiełko przedmiotowe nakraplamy surowicę antyglobulinową (IgG) - dodajemy zawiesinę erytrocytów noworodka – mieszamy - ink w komorze wilgotnej – wytworzenie się agregatów (zajście hemaglutynacji) - wynik odczytuje się makroskopowo - pierwszy poród = immunizacja matki	- 0,85% NaCl + zawiesina badanych erytrocytów - zawiesina krwinek grupy 0Rh+ (opłaszczonych przeciwciałami anty D) + surowica antyglobulinowa -0Rh+ + surowica antyglobulinowa
Odczyn antyglobulinowy Coobsa (pośredni)		- wykrywanie obecności przeciwciał anty D układu Rh w surowicy matki (gdy podejrzenie o konflikt serologiczny) - wykrywanie przeciwciał przeciwko tyreoglobulinie - wykrywanie przeciwciał przeciwko globulinom (w tym czynnika reumatoidalnego RF)	dwa etapy: 1. probówka: ospłaszczanie erytrocytów wzorcowych, inkubacja badanej surowicy matki z erytrocytami wzorcowymi 0Rh+ - jeżeli antyD są obecne zachodzi spłaszczanie krwinek tymi przeciwciałami 2. szkiełko przedmiotowe: nakraplamy surowicę antyglobulinową, dodajemy wcześniej inkubowane surowicę z erytrocytami aglutynacja - wynik po 2 min, makroskopowo	- 0Rh+ + surowica antyD + surowica antyglobulinowa (hemaglutynacja!) - 0Rh- + surowica antyD + antyglobulinowa surowica (bez hemaglutynacji) -0,85% NaCl + zawiesina erytrocytów wzorcowych inkubowanych z zawiesiną erytrocytów
Oznaczanie aktywności hemolitycznej dopełniacza CH50	Hemoliza immunologiczna na erytrocytach – poprzez przyłączenie się dopełniacza do kompleksu A-P	- informuje o całkowitym przebiegu klasycznej drogi aktywacji - określamy poziom i aktywność dopełniacza	- erytrocyty barana (antygeny?) opłaszczone przeciwciałami króliczymi - dodajemy kolejne rozcieńczenia surowicy z dopełniaczem - liza erytrocytów - wirowanie, dzielimy na frakcje (osad, supernatant – hemoglobina) - zmierzenie ekstynkcji (gęstość optyczna jest wprost proporcjonalna do ilości shemolizowanych erytrocytów)	Ustalenie ilości surowicy wywołującej 50% lizę erytrocytów barana opłaszczonych amboceptorem (przeciwciała królicze skierowane przeciwko erytrocytom barana)
Odczyn wiązania dopełniacza OWD	Hemoliza immunologiczna na erytrocytach – poprzez przyłączenie się dopełniacza do kompleksu A-P	- wykrywanie przeciwciał albo antygenów - diagnostyka mikrobiologiczna wielu chorób (wirusowe, bakteryjne, grzybicze) - test ilościowy, czyli wykonywanie miana antygenu lub przeciwciał	Dwa etapy: 1. surowica zinaktywowana (poszukiwane przeciwciała) + znany antygen + dopełniacz 2. dodajemy układ wskaźnikowy (erytrocyty barana opłaszczone przeciwciałami antyerytrocytanymi królika) Wynik + obecność w badanym materiale poszukiwanego składnika (A-P w pierwszym etapie, brak dopełniacza w roztworze, brak lizy) Wynik – (brak przeciwciał w surowicy hemoliza, kolor żywo czerwony)	Elementy: - surowica inaktywowana (termicznie 56C przez30 minut) - erytrocyty barana - przeciwciała przeciwerytrocytarne (amboceptory) pochodzenia króliczego ( na erytr barana) - dopełniacz (surowica świnki morskiej) Ilościowy odczyn wiązania dopełniacza: surowicę dodaje się w kolejnych rozcieńczeniach, pozostałe składniki stałe objętości, wynik podaje się jako odwrotność największego rozcieńczenia surowicy, które spowodowało zahamowanie hemolizy	- badana surowica + dopełniacz + zawiesina opłaszczonych erytrocytów (hemoliza) - reagent znany + dopełniacz + zawiesina opłaszczonych erytrocytów (hemoliza) - dopełniacz + opłaszczone erytrocyty (bez hemolizy)
Oznaczanie ASO test probówkowy	Hamowanie hemolizy erytrocytów wywołanej przez streptolizynę O – po jej ilościowym związaniu przez antystreptolizynę ASO	- ocena poziomu ASO w surowicy - różnicowanie chorób reumatycznych - diagnozowanie trwających lub przebytych zakażeń paciorkowcowych	- szereg probówek kolejne rozcieńczenia surowicy - stałe stężenie Streptolizyny O inkubacja - dodaje się 5% zawiesiny erytrocytów królika jako wskaźnik inkubacja Wynik (+) gdy nic się nie stanie z erytrocytami, kompleksy A-P, obecność ASO Wynik (-) streptolizyna O powoduje lizę krwinek	- paciorkowce B hemolizujące z grupy A - miano surowicy – największe rozcieńczenie surowicy, w której wystąpił jeszcze wynik +	- erytrocyty wskaźnikowe + 0,85% NaCl (brak hemolizy) - erytrocyty wskaźnikowe + badana surowica nie rozcieńczona (brak hemolizy) - erytrocyty wskaźnikowe + wzorcowa SO (hemoliza)
Oznaczanie ASO test lateksowy			- lateks opłaszczony SO - na karton z ciemnym tłem - kropla badanej surowicy, w której poszukujemy ASO - 2 minuty, wynik (+) lub (-)
Test limfocytotoksyczny (cytotoksyczny) – metoda morfologiczna (jest jeszcze metoda izotopowa)	Zjawisko niszczenia komórek docelowych (limf.) w obecności swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom powierzchniowym tych Komorek docelowych (w obecności dopełniacza).	- wykrywanie antygenów i przeciwciał w płynach ustrojowych - miano przeciwciał skierowanych przeciwko limfocytom, kom nowotworowym, makrofagom - miano przeciwciał skierowanych przeciwko HLA (antygeny zgodności tkankowej) - określanie antygenów HLA	- zawiesina: limfocyty pacjenta izolowanej z krwi obwodowej - swoiste surowice odpornościowe (o znanej swoistości) skierowane przeciwko HLA (surowice antyHLA) - dopełniacz króliczy -płytki terasaki z zagłębieniami, zagłębienia wypełnia się olejem parafinowym - pod parafinę wprowadza się surowicę anty-HLA inkubacja - dodaje się dopełniacz inkubacja - dodaje się barwnik eozynę, po kilku minutach formalinę - wynik: mikroskop świetlny (liczymy komórki martwe, czyli wybarwione) odsetek komórek barwnych! Wynik ujemny <25% martwych Wynik wątpliwy 26-45% Wynik dodatni (obecny antygen HLA)
Metody izolacji komórek	- źródło: wiele narządów i tkanek, najczęściej uzyskuje się je z krwi obwodowej i litych skupisk komórek limfoidalnych (węzły chłonne, migdałki) - do badań: limfocyty T, B, monocyty, granulocyty, NK 1. otrzymywanie zawiesiny: krew pobiera się na heparynę lub cytrynian sodu w celu (-) krzepnięcia i poddaje się sedymentacji. 2. wyizolowanie z otrzymanej zawiesiny komórkowej określonej populacji komórek. (wirowanie na gradientach gęstości; metody adherencyjne; eliminacja komórek na drodze szoku osmotycznego – usunięcie z zawiesiny erytrocytów; metody z zastosowaniem imunoadsorbentów – cząstki opłaszczone przeciwciałami skierowane przeciwko antygenom powierzchniowym danej populacji komórek); metoda izolacji magnetycznej z zastosowaniem paramagnetycznych cząstek polistyrenu; metoda z wykorzystaniem zjawiska fagocytozy; tworzenie rozet (zjawisko spontanicznego wiązania się erytrocytów barana z limfocytami T człowieka!) należy policzyć wyizolowane komórki i określić czystość danego preparatu (w rozmazie barwionym barwnikiem May-Giemza), należy ocenić żywotność komórek po dodaniu barwnika przyżyciowego
Techniki oceny fenotypu limfocytów – technika rozet E	Oparte na identyfikacji charakterystycznych elementów powierzchni komórek – tzw antygenów różnicowania CD	- ilościowe określenie populacji limfocytów T - ocena fenotypu limf T	- limfocyty T posiadają R dla krwinek czerwonych barana (antygen CD2), wiążą erytrocyty barana i tworzą z nimi formy rozetowe - 0,5% zawiesinę erytrocytów barana inkubuje się z zawiesiną limfocytów krwi obwodowej - po odwirowaniu z kropli zawiesiny wykonuje się preparat i wynik ocenia w mikroskopie - zlicza się formy tworzące rozety (forma z co najmniej 3 krwinkami)
Techniki oceny fenotypu limfocytów – technika immunofluorescencji		- ocena fenotypu	- z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych - szkiełka z zagłębieniami, do zagłębień nanosi się zawiesinę badanych komórek, inkubuje i płucze płynem hodowlanym - osady komórkowe utrwala się 1% buforowanym formaldehydem - dodaje się przeciwciała monoklonalne o danej swoistości – inkubacja i odpłukanie nadmiarów - dodaje się przeciwciała skierowane przeciwko mysiej IgG znakowane fluoresceiną – inkubacja, odpłukanie nadmiarów nie związanych przeciwciał - zagłębienia wypełnia się 50% glicerolem i wynik ocenia się w mikroskopie fluorescencyjnym.
Test transformacji blastycznej limfocytów		- ocena funkcji (test In vitro) limfocytów T i B - określenie stanu ogólnego czynnościowego limfocytów - wykrywanie defektów układu immunologicznego (zależne od wad komórek)	- In vivo proliferację wywołują antygeny (in vitro – antygeny, lub nieswoiste czynniki mitogenne np. lektyna) - w teście najczęściej używa się antygenów: oczyszczone tuberkulina PPD, anatoksyna tężcowa, anatoksyna błonicza, LPS, surowice antylimfocytarne i antyimmunoglobulinowe. - probówki albo mikropłytki hodowlane - test przeprowadza się na izolowanej frakcji limfocytów - zawiesinę inkubuje się w obecności lektyny - po inkubacji ocenia się wynik na podstawie odsetka komórek transformujących Metoda morfologiczna – z osadu komórek stymulowanych mitogenem wykonuje się rozmaz i barwi go metodą Pappenheima, gotowe preparaty ogląda się w mikroskopie, oceniając cechy morfologiczne komórek Metoda izotopowa – oparta na pomiarze inkorporacji radioaktywnie znakowanych prekursorów kwasów nukleinowych lub znakowanych prekursorów białek ????? WTF!	Transformacja blastyczna - zjawisko polegające na przechodzeniu limfocytów dojrzałych w formy niedojrzałe (blasty) pod wpływem stymulacji swoistej lub nieswoistej	Próby kontrolne danych limfocytów bez czynnika mitogennego
Metody oceny degranulacji bazofilów/ ocena aktywacji komórek – metoda morfologiczna			- bazofile z krwi obwodowej + alergen - jeżeli doszło do aktywacji komórek to zaszła też degranulacja - barwimy błękitem toluidyny - zliczamy całkowita liczbę oraz zdegranulowane (tzw. Odsetek bazoilów)
Metody oceny degranulacji bazofilów/ ocena aktywacji komórek – metoda cytofluorymetryczna			- dwa przeciwciała: 1. przeciwciało anty IgE, PE fikoerytryna, flourochrom - do wykrywania wszystkich bazofilów w preparacie - fikoerytryna świeci na czerwono 2. anty GP-53 FLTC, glikoproteina na powierzchni bazofilów zaktywowanych - świeci na zielono - wrzucamy do cytofluorymetru – liczy bazofile oraz dzieli je na czerwone i zielone	- BAZOTEST
Test uwalniania histaminy – metoda fluorymetryczna		-	- OPT 9aldehyd ortoftalowy) + histamina --. Kompleks OPT-histamina (kompleks fluorescencyjny) - spektrofluorymetr – natężenie świecenia jest wprost proporcjonalne do stężenia histaminy	- inkubacja zawiesiny komórek tucznych lub bazofilów z alergenem - aktywacja do uwalniania histaminy
Test uwalniania histaminy – metoda immunoenzymatyczna			- płytki ze studzienkami: przeciwciała monoklonalne + próbka badana - jeżeli mamy histaminę to powstaną kompleksy histamina-przeciwciało - opłukujemy - dodajemy znowu przeciwciał monoklonalnych – opłukujemy - dodajemy przeciwciała II rzędowe antyglobulinowy znakowane enzymem. - + substrat dla tego enzymu produkt barwny
Test CAST-ELISA			- bazofile/mastocyty inkubujemy z alergenem oraz IL-3 i IL-5 - przeciwciała monoklonalne przeciwko LT - kompleksy leukotrien-przeciwciało płuczemy - przeciwciała przeciwko LT płuczemy - dodajemy przeciwciała II rzędowe znakowane enzymem + substrat dla tego enzymu	- test immunoenzymatyczny - badanie leukotrienów LT - leukotrieny top eikozanoidy powstające z kwasu arachidonowego w wyniku działania enzymu 5-lipooksygenazy
Metody oceny adherencji fagocytów – zdolność przylegania i n vitro	Zdolność fagocytów do adhezji do powierzchni stałych (kolumny wypełnione wata nylonową, plastykowe naczynia hodowlane, powierzchnie szklane)	- inkubacja komórek w plastykowych naczyniach hodowlanych – w płynie hodowalnym z dodatkiem 10% FCS i PMA - odpłukanie komórek nieadherujących - dodaje się barwnik MTT inkubuje, nadmiar odpłukujemy - komórki które zaadherowały przekształcają barwnik w farmazon, barwy niebieskiej - pomiar spektrofluorymetryczny wytworzonego farmazanu = adherencja komórek	W badaniach sprawności funkcjonalnej komórek fagocytujących używa się zawiesiny komórek uzyskanych z krwi, wysięku otrzewnowego lub płuc
Metody badania migracji fagocytów	1.komora Boydena – dwa przedziały przedzielone filtrem nitrocelulozowym o określonej wielkości porów. W części górnej umieszcza się zawiesinę badanych komórek, w dolnej – czynnik chemotaktyczny. Błonę filtru wybarwia się badanie makroskopowe jaki dystans przebyły komórki 2. pod agarozą – na płytce Petriego wycina się 3 studzienki, środkowa – zawiesina badanych komórek, prawa – czynnik chemotaktyczny, po lewej płyn hodowalny. Inkubacja. Barwi się metodą pappenheima, wynik pomiar drogi jaką przebyły komórki w kierunku czynnika chemotaktycznego w stosunku do drogi jaką przebyły komórki, w kierunku studzienki z płynem hodowalnym (migracja swobodna!) IC
Metody badania fagocytozy	- określenie indeksu fagocytarnego - należy przygotować zawiesinę komórek fagocytowanych oraz cząsteczki do sfagocytowania (bakterie, drożdże, erytrocyty) - 1:6 - wymieszać to wszystko i inkubować przez 30 minut - odwirować zawiesinę i wykonać rozmaz - wybarwić barwnikiem i ocenic pod mikroskopem (liczba cząstek fagocytujących/komórek fagocytujących czyli około 100 komórek)
Metody oceny metabolizmu wewnkom. fagocytów	- test pochłaniania i redukcji NBT - odczynnik NBT w roztworze ma barwę żółta, - barwnik dostaje się do wnętrza komórki w czasie fagocytozy i ulega redukcji w fagolizosomach do nierozpuszczalnego farmazanu barwy granatowej - reakcję ocenia się mikroskopowo, a wynik podaje jako odsetek komórek fagocytującyh, czyli komórek posiadających ziarna farmazanu - na płytkach z zagłębieniami, do dołków dodaje się odczynnik NBT, zawiesinę badanych komórek oraz zawiesinę cząsteczek lateksu - z osadu na dnie wykonuje się rozmaz i barwi metodą Pappenheima
Test RAST (IRMA metody immunoradiometryczne)	Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników. [Wyznakowanie jednego ze składników reakcji antygen swoiste przeciwciało markerem]	- ilościowa ocena stężenia IgE skierowanych swoiście przeciwko danemu antygenowi (alergenowi) – ocena swoistej IgE	- probówka opłaszczona alergenem (a nie przeciwciałem anty IgE)!!! - inkubacja z badaną surowicą (kolejne rozcieńczenia) odpł - dodajemy przeciwciała anty IgE znakowanej jodem - pomiar związanej radioaktywności w kolejnych próbkach w porównaniu z radioaktywnością w próbach kontrolnych	- próba kontrolna to kolejne rozcieńczenia surowicy kontrolnej o znanym stężeniu przeciwciał o danej swoistości
Test RIST (IRMA metody immunoradiometryczne)		- ilościowa ocena poziomu IgE w surowicy (całkowity poziom)	- nośnik spłaszczamy anty IgE!!! (króliczym) - dodajemy surowicę – kolejne rozcieńczenia inkubacja - + anty IgE znakowane jodem - mierzymy poziom radioaktywności w próbce (próbka = surowica)	- inkubacja nośnika z anty IgE + surowica wzorcowa o znanym stężeniu przeciwciał
Techniki ELISA (EIA)	Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników (metody pośrednie)	- ilościowa ocena w badanym materiale antygenu lub przeciwciała - ocena stężenia białek w wielu płynach ustrojowych (np. hormony, wykrywanie obecności autogenów?) - diagnostyka chorób?	- mikropłytki z dołkami opłaszczone przeciwciałami (skierowane przeciwko antygenowi) - dodajemy próbkę badanej surowicy – Ink – odpł - dodajemy przeciwciała przeciw antygenowi – inkubujemy – odpł komplekst P-A-P - dodajemy przeciwciała II rzędowe związane z enzymem - dodajemy H2O2 i chromagen (pod wpływem enzymu utleniany do barwnego produktu) Wynik na podstawie barwy roztworu – metody spektrofluorymetryczne, natężenie barwy ~ stężenia antygenu	Równolegle próby dodatnie i ujemne (niezawierające poszukiwanego przeciwciała), krzywa kalibracyjna
Techniki immunomorfologiczne EIA - PAP	Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników. Metody pośrednie – I etap to reakcja między nieznakowanymi A-P, a potem II etap: czyli znakowane przeciwciała antyglobulinowe Rodzaj użytego znacznika określa rodzaj techniki immunomorfologicznej.	- wykrywanie obecności przeciwciała lub antygenu związanego bezpośrednio z komórka lub tkanką - metody jakościowe i ilościowe - wykrywanie obecności antygenów nowotworowych na komórkach - różnicowanie nowotworów o nie znanym pochodzeniu - wykrywanie obecności kompleksów immunologicznych w tkankach - wykrywanie obecności antygenów pasożytów, antygenów bakteryjnych i wirusowych - określanie typu immunoglobulin i antygenów różnicowania komórek limfoidalnych z zespołach limfoproliferacyjnych	- oznaczamy antygen (skrawek tkanki) + przeciwciała kompleks A-P (pierwony) - dodajemy przeciwciała mostkujące (II rzędowe) - mostek = pośrednia warstwa nieznakowanych przeciwciał - kompleks PAP - dodajemy H2O2 i chromagen- reakcja erdoks – przekształcanie się w barwny związek
Techniki immunomorfologiczne EIA - APAAP			- j.w. - do substratu należy dodać lewami zol dla zahamowania aktywności fosfatazy endogennej
Techniki immunomorfologiczne EIA			- reakcja ABC przy użyciu układu biotyna-awidyna (duże powinowadztwo do siebie) - poszukujemy antygenu w tkance - + przeciwciało pierwotne (kompleks A-P pierwotny I rzędowy) - + przeciwciało II rzędowe wtórne biotynylowane (związane z biotyną) - + kompleks awidyna0biotyna (komplekst ABC) łączy się z przeciwciałem II rzędowym biotynylowanym - + H2O2 i chromagen Wynik: aktywność peroksydazy w reakcji enzymatycznej		Zasada rekacji oparata na duzym powinowadztwie biotyny do awidyny
PCR	- w biologii molekularnej: sekwencjonowanie DNA, namnażanie RNA w postaci DNA, mapowanie DNA – lokalizacja położenia genu w chromosomie, filogenetyka molekularna	- namnażanie i powielanie cząsteczek DNA - reakcja termocykler - enzym (polimeraza DNA), jony magnezu dla polem razy - nukleotydy – na nową nić DNA - startery	Przebieg Denaturacja DNA – rozplecienie helisy Hybrydyzacja – przyłączanie się starterów Elongacja – przyłączanie komplementarnych nukleotydów
Cytofluorymetria przepływowa	- wieloparametrowa ocena komórek znajdujących się w zawiesinie - można je sortować na frakcje (urządzenie sorter) - określenie liczebności poszczególnych komórek w zawiesinie - ocena stanu czynnościowego komórek - ocena fenotypu – badania właściwość, wielkości, kształtu, ilości DNA	- urządzenie cytometr (budowa: źródło lasera i dwa detektory) jeden detektor mierzy wiekość komórki, drugi służy do oceny ziarnostości - materiał: zawiesina komórek - komórki znajdujące się w zawiesinie są kierowane do kanału w strumieniu cieczy - wiązka światła oświetla przepływające komórki i ulega zagięciu oraz rozproszeniu i wzbudza fluorescencję (lasery), następnie światło to trafia do detektorów - wszystko to połączone jest z komputerem, który zbiera i ocenia dane