PODZIAŁ ENZYMÓW RESTRYKCYJNYCH.
Enzymy restrykcyjne, inaczej restryktazy – enzymy z grupy endonukleaz przecinające nić DNA w miejscu wyznaczanym przez specyficzną sekwencję DNA.
Enzymy restrykcyjne naturalnie występują u bakterii i sinic, stanowiąc element tzw. systemu "restrykcji-modyfikacji". System ten chroni komórkę przed wnikaniem obcego DNA (np. DNA bakteriofagów).
Wyróżnia się następujące typy enzymów restrykcyjnych:
Typ I - wielopodjednostkowe kompleksy enzymatyczne zawierające aktywności metylazy i restryktazy. Przecinają DNA z dala od rozpoznawanej sekwencji, w bliżej nieokreślonym miejscu.
Typ II - przecinają DNA w zdefiniowanym miejscu, w obszarze rozpoznawanej sekwencji lub w jej pobliżu. Składają się z pojedynczych polipeptydów. Rozpoznają sekwencje symetryczne (palindromowe).
Typ IIs - zbliżone do typu II, przecinają z jednej strony rozpoznawanej sekwencji, która jest asymetryczna.
Typ III- duże kompleksy, które wymagają dwóch sekwencji rozpoznawanych w pobliżu siebie. Bez znaczenia praktycznego.
Typ IV - zbliżone do typu II. Zawierają aktywność metylazy i restryktazy w tym samym polipeptydzie. Przecinają DNA w zdefiniowanym obszarze poza sekwencją rozpoznawania. Aktywności metylazy i restryktazy nie mogą działać równocześnie. Enzym "przełącza" się w zależności od substratu.
Enzymy restrykcyjne rozpoznające tę samą sekwencję DNA a przecinające DNA w odmiennych miejscach nazywamy neoschizomerami.
Enzymy restrykcyjne, różniące się sekwencją swojego polipeptydu i pochodzące z odmiennych organizmów, a rozpoznające tę samą sekwencję DNA i przecinające DNA w takim samym miejscu nazywamy izoschizomerami.
REGUŁA CHARGAFFA
Zgodnie z tą regułą zawsze w prawidłowej cząsteczce DNA całkowita liczba cząsteczek puryn jest równa całkowitej liczbie cząsteczek pirymidyn (A + G = T + C) oraz jednocześnie liczba cząsteczek adeniny (A) jest równa liczbie cząsteczek tyminy (T) (A = T), natomiast liczba cząsteczek guaniny jest równa liczbie cząsteczek cytozyny (G = C). Reguła ta oparta jest na komplementarności A do T i C do G w sąsiednich niciach podwójnej helisy DNA, o czym wspominałem na poprzedniej lekcji.
GENY POLICISTRONOWE A MONOCITRONOWE
Cząsteczka monocistronowego mRNA to taka, która zawiera informację genetyczną tylko o jednym łańcuchu polipeptydowym. Jest to sytuacja dla większości mRNA eukariota. Z kolei mRNA policistronowe zawiera na pojedynczej nici informację o kilku białkach, które podlegają normalnej translacji. Takie mRNA jest powszechne u bakterii i bakteriofagów. mRNA policistronowe jest m.in. efektem transkrypcji genów wchodzących w skład jednego operonu.
W przypadku nici mRNA kodującej dokładnie dwa białka, używa się czasem terminu mRNA dicistronowe.
KTÓRA NIĆ DAJE NIĆ SENSOWNĄ – MATRYCOWA CZY KOMPLEMENTARNA.
sensowna nić, nić kodująca- jedna z nici DNA, której sekwencja nukleotydowa jest identyczna z sekwencją pierwotnego produktu transkrypcji danego genu (wyjąwszy zamianę tyminy na uracyl w RNA);
nić sensowna jest komplementarna do nici antysensownej (niekodującej, matrycowej); termin „nić sensowna” odnosi się do danego genu, a nie do całej cząsteczki DNA.
GYRAZA- enzym występujący u Procaryota , należący do topoizomeraz typu II. Przy użyciu energii pochodzącej z hydrolizy ATP katalizuje on wprowadzanie ujemnych skrętów w helisie DNA. Gyraza odgrywa ważną rolę w procesie replikacji, transkrypcji oraz rekombinacji.
TOPOIZOMERAZY- należą do rodziny enzymów biorących udział w procesach związanych z metabolizmem DNA: transkrypcji, replikacji, rekombinacji i kondensacji chromosomów. Usuwają one napięcia torsyjne DNA (tzw. superskręcenia), które pojawiają gdy kompleksy białkowe biorące udział w/w procesach poruszają się wzdłuż DNA rozplatając przed sobą podwójną helisę. W zależności od tego czy zostanie przecięta jedna czy dwie nici DNA, wyróżniamy topoizomerazy typu I oraz II. T. typu I w procesie relaksacji DNA nacina jedną nić, natomiast t. II rozcina obie nici. Topoizomerazy można podzielić również ze względu na miejsce wiązania. Topoizomerazy klasy A łączą się z resztą fosforanową 5’, a klasy B resztą 3’ w DNA.
LIGAZA DNA - enzym łączący wolne końce cząsteczek DNA.
Przykłady działania ligazy DNA
podczas replikacji DNA na pewnym etapie nowa nić DNA składa się z oddzielnych fragmentów, tzw. fragmentów Okazaki. Za ich połączenie odpowiada ligaza
uszkodzenia DNA w komórce doprowadzające do przerwania nici naprawia m.in. ligaza
ligaza jest także jednym z kluczowych enzymów używanych w biologii molekularnej i inżynierii genetycznej
HELIKAZY - grupa enzymów, które łączą się niespecyficznie z podwójną helisą DNA, sparowanymi nićmi RNA lub hybrydami DNA-RNA, rozplątują je i rozrywają wiązania wodorowe pomiędzy zasadami azotowymi, powodując rozdzielenie nici. Wprowadzane są one do otwartego kompleksu w miejscu inicjacji replikacji wraz z innymi białkami, których uwolnienie aktywuje helikazę po czym rozpoczyna się proces replikacji.
PRYMAZA – enzym biorący udział w replikacji DNA, odmiana polimerazy RNA zależnej od DNA. Primaza jest aktywowana przez helikazę DNA i po aktywacji syntezuje na obu niciach DNA krótkie komplementarne odcinki (primery) starterowego RNA wykorzystywane przez polimerazę DNA do rozpoczęcia syntezy nowych nici DNA w procesie.
SSB - białko, które po rozpleceniu helisy DNA przez helikazę przyłącza się do jednoniciowego DNA zapobiegając ponownej asocjacji nici, tak więc rozpleciona nić jest dostępna dla polimerazy DNA, która wymaga jednoniciowego DNA, jako matrycy do replikacji DNA. U eukariotów odpowiednikami białek SSB są białko RPA.
POLIMERAZA - enzym katalizujący syntezę DNA w czasie replikacji lub naprawy DNA. Synteza ta polega na polimeryzacji deoksyrybonukleotydów przez wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych między nimi. Substratami do tej reakcji są nukleotydy trójfosforanowe. Większość polimeraz DNA wymaga matrycy, w formie jednoniciowego DNA lub RNA, z krótkim obszarem dwuniciowym. Odcinek dwuniciowy powstaje przez przyłączenie się do jednoniciowej matrycy krótkiego komplementarnego do matrycy odcinka DNA lub RNA, zwanego primerem lub starterem.
*Polimeraza DNA I
Enzym zbudowany z pojedynczego łańcucha polipeptydowego. Posiada trzy aktywności enzymatyczne, co jest nietypowe dla monomeru: polimerazowa, egzonukleazowa 3' → 5' weryfikuje poprawność wbudowanych nukleotydów i jeśli trzeba wycina je, egzonukleazowa 5' → 3' – jak rybonukleaza wycina startery RNA i syntetyzuje w to miejsce DNA. Wycina także dimery pirydynowe.
*Polimeraza DNA II
Enzym monomeryczny, posiadający dwie aktywności: polimerazowa, egzonukleazowa 3' → 5'. Jest głównie zaangażowana w sprawdzanie poprawności replikacji i w naprawę DNA.
*Polimeraza DNA III
Enzym heteromultimeryczny (złożony z kilku niejednakowych łańcuchów polipeptydowych), będący głównym inicjatorem replikacji DNA.
W odróżnieniu od polimerazy DNA I działa w sposób ciągły, to znaczy oddysocjowuje od matrycy dopiero po zakończeniu replikacji. Łączy się tylko z jednoniciowym DNA, do którego przyłączony jest starter, wytwarzany przez enzym prymazę, wchodzący w skład prymosomu. Przyłączając się do prymosomu polimeraza III przekształca go w replisom.
Aktywności enzymatyczne: polimerazowa, egzonukleazowa 3' → 5'.
ANTYBIOTYKI STOSOWANE W TERAPII CELOWANEJ MOLEKULARNIE:
Terapia celowana molekularnie to forma leczenia nowotworów zaliczana do chemioterapii, choć używa się w niej leków, które nie są typowymi cytostatykami. Jest ona oparta na lekach planowanych molekularnie, czyli takich, które wykorzystują swoiste mechanizmy komórkowe, blokując te mechanizmy albo receptory komórek nowotworowych. Przykładem metody celowanej stosowanej w celu wyłączenia nadaktywności białka jest lek o nazwie Glivec stosowany w przewlekłej białaczce, Herceptyna – w leczeniu jednego z typów raka piersi czy Terceva (erlotinib) – w leczeniu celowanym raka płuc.
RODZAJE RYBOZYMÓW
Rybozymy - substancje zbudowane z kwasu rybonukleinowego (RNA) zdolne do katalizowania pewnych reakcji chemicznych. Spełniają zatem funkcje analogiczne do enzymów białkowych. Występują u wszystkich organizmów, przede wszystkim w mechanizmie syntezy białek oraz przemian kwasów nukleinowych.
Rodzaje rybozymów
Ze względu na budowę oraz rodzaj katalizowanej reakcji rybozymy dzielimy na :
pierwszej grupy katalizują reakcje wycinania z nici substratu produktu, który posiada na końcu 3’ grupę hydroksylową a na końcu 5’ - fosforan. Wyróżniamy tutaj dwa typy rybozymów: introny grupy I i II. Różnią się one rodzajem cząsteczki, która dokonuje ataku na miejsce splicingowe 5’. W intronach grupy I jest nią kofaktor guanozynowy, zaś grupy II – grupa 2’-hydroksylowa reszty adenylanowej intronu.
kolejnej grupy rybozymów zaliczamy te cząstki, które katalizują reakcje prowadzące do powstania produktów o końcach 5’-hydroksylowym i cyklicznym – 2’, 3’-fosfodiestrowym. Rybozymy te różnią się między sobą strukturą centrum katalitycznego. Najczęściej spotykane to rybozymy typu „głowa młotka” (z ang. hammerhead) oraz typu „spinki” (z ang. hairpin).
Rybozymy typu hammerhead to wiroidy ulegające autokatalitycznemu splicingowi. Zbudowane są z trzech ramion odchodzących promieniście od środka składającego się z niesparowanych nukleotydów
RNaza P bierze udział w dojrzewaniu końca 5’ tRNA u bakterii, archeowców czy Eukariota. In vivo występuje w postaci holoenzymu (katalizę wspomaga kofaktor. Aktywność enzymatyczną warunkuje RNA M1, rozpoznając właściwe miejsca na nici pierwotnego transkryptu.
ENZYMY UCZESTNICZĄCE W NAPRAWIE DNA.
Topoizomeraza zdolny do powodowania zarówno pojedynczych, jak i podwójnych pęknięć nici DNA w procesie zmiany "superzwiniętej" (ang. supercoiled) struktury DNA na formę zwiniętą, szczególnie w okolicy otwartych widełek replikacyjnych
ligaza DNA IV tworząca zespół z czynnikiem XRCC4, łączy dwa rozerwane zakończenia,
wyspecjalizowe typy polimerazy DNA, które moga wstawiać zasady w miejscach uszkodzenia
MECHANIZMY NAPRAWY DNA PRZEZ WYCINANIE :
BER (ang. base excision repair) – koryguje niewielkie uszkodzenia poprzez wycinanie i naprawianie pojedynczych zasad, które uległy modyfikacjom chemicznym (np. alkilacji, deaminacji). Proces ten zachodzi etapowo:
• Odpowiednia glikozydaza DNA przecina wiązanie β-N-glikozydowe, a następnie usuwa uszkodzoną zasadę tworząc miejsce AP (apurynowe lub apirymidynowe).
• Endonukleaza AP rozpoznaje to miejsce i przecina wiązanie fosfodiestrowe w kierunku 5’ od powstałego uszkodzenia. W ten sposób powstają wolne końce 3’- OH.
• Wiąże się do nich polimeraza DNA I (Pol I), która następnie wypełnia lukę nową nicią syntetyzowaną na martycy DNA. U różnych organizmów w procesie tym biorą udział różne rodzaje polimerazy.
• Na koniec ligaza DNA łączy obie nici i syntetyzuje ostatnie wiązanie fosfodiestrowe.
Niektóre glikozydazy wykazują dodatkową aktywność nukleolityczną. Nacinają one łańcuch po stronie 3’ miejsca AP i tworzą jednonukleotydową lukę w DNA.
NER (ang. nucleotide excision repair) – poprzez wycinanie uszkodzonych nukleotydów usuwa duże uszkodzenia DNA zniekształcające strukturę podwójnej helisy. Wycinany odcinek może być różnej długości.
• Białka XPA i XPC rozpoznają uszkodzenie.
• Endonukleazy XPG i XPF nacinają nić DNA po obu stronach powstałego błędu.
• Helikazy XPB XPD rozplatają podwójną helisę w sąsiedztwie uszkodzonego nukleotydu, a następnie uwalniają fragment zawierający zmianę.
• Usunięty odcinek uzupełniany jest dzięki aktywności enzymu polimerazy DNA.
• Ligazy łączą ze sobą obie nici.
DWUNICIOWE PĘKNIĘCIA DNA
Zależnie od typów uszkodzeń, które zaszły w dwuniciowej strukturze DNA, w toku ewolucji wykształciło się wiele strategii naprawczych, mających za zadanie kompensować i likwidować uszkodzenia. Jeśli jest to możliwe, komórki używają zazwyczaj nieuszkodzonej nici komplementarnej lub chromatydy siostrzanej jako matrycy do odtworzenia oryginalnej informacji na uszkodzonym elemencie komplementarnym. W przypadku braku takiej możliwości, używany jest awaryjny mechanizm syntezy DNA, zwany TLS (ang. Translesion DNA Synthesis).
KLASY CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH U EUKARIOTA
Czynnik transkrypcyjny jest białkiem wiążącym DNA na obszarze promotora bądź sekwencji wzmacniającej w specyficznym miejscu lub regionie, gdzie reguluje proces transkrypcji. Czynniki transkrypcyjne mogą być selektywnie aktywowane, bądź dezaktywowane przez inne białka, najczęściej na ostatnim etapie przekazywania sygnału w komórce.
organizmów eukariotycznych czynniki transkrypcyjne zasadniczo dzielą się na dwie grupy. Pierwszą grupę stanowią ogólne czynniki transkrypcyjne (GTF, ang. general transcription factors), odpowiadające za wskazanie miejsca rozpoczęcia transkrypcji oraz za samo jej rozpoczęcie. Druga grupa składa się ze specyficznych czynników transkrypcyjnych (STF, ang. specific transcription factors), których rola ogranicza się do przyspieszania lub hamowania transkrypcji konkretnych genów w odpowiedzi na sygnały wysyłane przez komórkę do jądra komórkowego. Czynniki grupy pierwszej pozostają aktywne przez cały czas, gdyż odpowiadają za prawidłowy przebieg transkrypcji w stanie podstawowym, czynniki specyficzne natomiast ulegają aktywacji bądź inhibicji, w zależności od zapotrzebowania komórek na konkretne białka.
KLASY CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH U PROKARIOTA
?
MOTYWY BIAŁKOWE
Białka wiążące DNA – szeroka klasa białek posiadających motywy strukturalne pozwalające im na wiązanie się do dwu- lub jednoniciowego DNA. Przykładem takich białek mogą być czynniki transkrypcyjne, których funkcją jest regulacja ekspresji genów oraz niektóre polimerazy zależne od kwasów nukleinowych, zaangażowane w replikację DNA i transkrypcję na mRNA.
Motywy strukturalne wiążące DNA:
helisa-skręt-helisa, palec cynkowy, zamek leucynowy (suwak leucynowy), helisa-pętla-helisa,
uskrzydlona helisa-pętla-helisa
Nie należy mylić motywów bIałkowych, które są strukturami superdrugorzędowymi białek z domenami białkowymi, które stanowią struktury trzeciorzędowe.
STRATEGIA ANTYSENSOWNA A ANTYGENOWA
Oligonukleotydy antysensowe –komplementarne do mRNA docelowego genu, hamującego jego ekspresję poprzez blokadę translacji.
Oligonukleotydy antygenowe - tworzące trypleksy z dwuniciowym DNA i hamujące jego transkrypcję.
NAZWEWNICTWO ENZYMÓW RESTRYKCYJNYCH.
Nazwy enzymów z reguły są tworzone od pierwszej litery nazwy rodzajowej i dwóch pierwszych liter nazwy gatunkowej, pisanymi kursywą. Po nich może wystąpić kilka liter lub cyfr arabskich oznaczających szczep bakterii. Nazwa zakończona jest rzymską cyfrą oznaczającą, jako który kolejny enzym został on wyizolowany z danego szczepu.
RODZAJE HYBRYDYZACJI KWASÓW NUKLEIONOWYCH
Hybrydyzacja to zjawisko spontanicznego parowania się zasad pochodzących z różnych nici kwasów nukleinowych. Może zachodzić pomiędzy dwiema cząsteczkami DNA, RNA lub DNA i RNA, o całkowitej lub częściowej komplementarności. Stabilność przyłączonych odcinków zależy od ilości zasad tworzących wiązania. Na drodze klonowania lub syntezy chemicznej otrzymuje się fragmenty kwasów nukleinowych zwane sondami molekularnymi. Mają one ściśle określoną sekwencję nukleotydową i są łączone z innymi cząsteczkami związanymi na filtrze lub znajdującymi się w preparatach cytologicznych i histologicznych. Podstawową cechą hybrydyzacji jest specyficzność wykorzystywanych sond. Można je projektować samodzielnie, po uprzednich analizach badanego materiału genetycznego. Jednak ze względu na ich dużą dostępność rozwiązanie to stosuje się jedynie w ostateczności. Wykorzystywane w biologii molekularnej metody hybrydyzacyjne pozwalają na umiejscowienie w cząsteczce DNA określonych sekwencji oraz na porównanie różnych fragmentów kwasów nukleinowych pochodzących z tego samego lub z różnych organizmów. Za ich pomocą można także wykrywać powstałe w cząsteczce DNA zmiany.
Do metod hybrydyzacyjnych należą:
Southern Blotting – służy do lokalizacji konkretnej sekwencji DNA po elektroforezie. Na drodze dyfuzji DNA przenoszone jest z żelu na membranę nitrocelulozowa lub nylonową. Inkubuje się ją ze znakowanymi izotopowo sondami komplementarnymi z poszukiwanym fragmentem, który następnie uwidacznia się na zdjęciu rentgenowskim.
Northern Blotting – czyli elektroforetyczno – hybrydyzacyjna detekcja transkryptów. Służy do poszukiwania sekwencji RNA i badania aktywności pojedynczych genów. Wykorzystuje się w niej sondy DNA wyznakowane radioaktywnie.
DNA fingerprinting, czyli metoda genetycznych odcisków palców – wyizolowane DNA trawi się odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, a następnie poddaje elektroforezie i przenosi na filtr nitrocelulozowy, gdzie łączą się z radioaktywnie wyznakowanymi sondami. W ten sposób otrzymuje się „genetyczne odciski palców”, czyli charakterystyczny dla danego osobnika układ pasków DNA.
MUTACJE DYNAMICZNE
mutacja polegająca na powieleniu się (ekspansji) fragmentu genu, zwykle o długości 3-4 nukleotydów. Jedną z prawdopodobnych przyczyn tej mutacji jest zjawisko poślizgu polimerazy DNA podczas replikacji DNA.
Mutacja dynamiczna jest przyczyną wielu neurodegeneracyjnych i neuromięśniowych chorób genetycznych, funkcjonujących w nomenklaturze medycznej pod wspólną nazwą chorób spowodowanych powtórzeniami trinukleotydów. Chorobom tym często towarzyszy zjawisko antycypacji – prawdopodobieństwo dalszego wydłużania się obszaru podlegającego ekspansji w kolejnych rundach replikacji ma tendencję wzrostową, przez co choroba z pokolenia na pokolenie ujawnia się wcześniej, a jej objawy są coraz cięższe.
Przykłady chorób genetycznych wywołanych mutacjami dynamicznymi
pląsawica Huntingtona typ dziedziczenia autosomalny dominujący
zespół łamliwego chromosomu X typ dziedziczenia sprzężony z chromosomem X dominujący
dystrofia miotoniczna typ dziedziczenia autosomalny dominujący
choroba Friedreicha typ dziedziczenia autosomalny recesywny
ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typ dziedziczenia autosomalny dominujący
choroba Kennedy'ego typ dziedziczenia sprzężony z chromosomem X recesywny
zanik jąder zębatych, czerwiennych, gałek bladych i ciał podwzgórzowych Luysa
BUDOWA POLMERAZY RNA ZALEŻNEJ OD DNA U PROKARIOTA
Polimeraza RNA wykorzystująca jako matrycę nić DNA to polimeraza RNA zależna od DNA.
Składa się ona z 5 podjednostek: dwóch podjednostek α rozpoznających czynniki regulatorowe, podjednostki β katalizującej syntezę RNA, podjednostki β' wiążącej niespecyficznie DNA i podjednostki ω tworzących razem część rdzeniową enzymu. Do związania się z sekwencjami promotorowymi potrzebna jest jeszcze szósta podjednostka – sigma (σ). Taki enzym określa się jako holoenzym.
DEKATENACJA
Topoizomeraza IV to nazwa bakteryjnej topoizomerazy II (ale nie gyrazy). Rózni się nieco
budową, ale głównie funkcją: odpowiedzialna jest za rozdział nowopowstałych kolistych chromosomów
bakteryjnych (czyli za dekatenację).
miRNA i siRNA
miRNA (mikroRNA) – jednoniciowe cząsteczki RNA o długości ok. 21-23 nukleotydów, regulujące ekspresję innych genów. Prekursorem są niewielkie RNA, o strukturze spinki do włosów, które ulegają obróbce podobnie do siRNA. Wchodzą w skład kompleksów rybonukleoproteinowych blokujących specyficznie translację mRNA i nadają im specyficzność. W odróżnieniu od siRNA, miRNA nie posiadają 100%-owej identyczności sekwencji do docelowego mRNA. miRNA są zaangażowane w negatywną regulację ekspresji genów podczas rozwoju; ocenia sie, ze biorą udział w regulacji 30% ludzkich genów. Są mediatorami mechanizmu interferencji z translacją mRNA.
siRNA (small interfering RNA)- dwuniciowe cząsteczki RNA o długości ok. 20-25 par zasad, które powodują wyciszanie ekspresji genów o homologicznej sekwencji (interferencja RNA - RNAi). Powstają przez pocięcie dwuniciowego RNA (np. wirusowego) w komórce przez enzym Dicer na fragmenty odpowiedniej długości. Krótkie siRNA wiążą się z kompleksem białkowym o aktywności rybonukleazy zwanym RISC. Kompleks ten wiąże się z komplementarną do siRNA cząsteczką mRNA i tnie ją na kawałki, uniemożliwiając w ten sposób powstanie kodowanego przez nią białka.