Obliczenia biochemiczne
Zadanie 1
Oznaczono szybkość początkową dla reakcji enzymatycznej przy różnych stężeniach substratu:
| Początkowe stężenie substratu - S0 | Szybkość początkowa - V0 [µmol/l/min] |
|---|---|
| 1 * 10-1 | 27 |
| 1 * 10-2 | 27 |
| 1 * 10-3 | 26 |
| 1 * 10-4 | 19,3 |
| 5 * 10-5 | 15 |
| 1 * 10-6 | 5,4 |
| 1 * 10-6 | 3 |
| 1 * 10-6 | 0,66 |
Szybkość maksymalna
(Vmax) wynosi 27, gdyż
nawet przy stężeniu
substratu 10 razy większym
V0 jest taka sama. Możemy
więc uznać, że jest to Vmax
tej substancji.
a/ Oblicz KM [Stała Michaelisa] oraz Vmax przy początkowym stężeniu 5*10-5 oraz 5*10-6.
Vmax [S0] V0 = ------------------ KM + [S0] 27 [S0] 15 = ---------------- 15 KM + 15 [S0] = 27 [S0] KM + [S0] 15 KM = 12 [S0] KM = 12/5 * 5*10-5 = 4*10-5 |
|---|
27 [S0] 3 = ----------------------- KM + [S0] 3 KM + 3 [S0] = 27 [S0] 3 KM = 24 [S0] KM = 8 * 5*10-6 = 40*10-6 = 4*10-5 |
|---|
b/ Znając KM i V0 przy określonym stężeniu substratu można obliczyć Vmax. Oblicz Vmax dla [S0] = 1*10-5.
Z tabeli odczytujemy, że V0 dla 1*10-5 wynosi 5,4. KM znamy z poprzedniego podpunktu i wynosi ono 4*10-5. Vmax [S0] V0 = ------------------ i przekształcamy wzór tak by niewiadomą była prędkość max: KM + [S0] V0KM + V0S0 = Vmax[S0] V0 (KM + [S0]) 5,4 * (4*10-5 + 1*10-5) 5,4 * 5 Vmax = --------------------- = -------------------------------- = ------------------- = 27 [S0] 1*10-5 1 |
|---|
c/ Oblicz V0 dla S0 = 4*10-5 oraz S0 = 8*10-5.
| Zgodnie z definicją KM przy stężeniu substratu [S0] = KM, reakcja osiąga połowę szybkości maksymalnej, to jest w tym przypadku: 27 : 2 = 13,5 |
|---|
Sprawdzenie: 27 * 4*10-5 27 * 4 V0 = -------------------------- = ------------------ = 13,5 4*10-5 + 4*10-5 8 Z tych obliczeń wynika, iż kiedy S0 = KM wtedy V = połowie Vmax, ale kiedy S0 = 2 KM, Szybkość NIE ulega podwojeniu i nie będzie wtedy maksymalna. Wzrost z 13,5 do 18 (a nie 27), gdyż 27 * 8*10-5 V0 = -------------------- = 18 4*10-5 + 8*10-5 |
|---|
d/ Oblicz szybkość początkową przy początkowym stężeniu substratu równym 5*10-3.
27 * 5*10-3 27 * V0 = ------------------- = ----------------------------- = -------------- = około 27 4*10-3 + 5*10-3 Jak widać przy S0 100 razy większym niż KM, szybkość reakcji jest praktycznie równa prędkości maksymalnej. |
|---|
e/ Oblicz prędkość początkową przy początkowym stężeniu substratu 5*10-5, jeżeli zostanie podwojone stężenie enzymu.
Szybkość reakcji jest prawie zawsze proporcjonalna do enzymu. Jeśli więc stężenie enzymu zostanie podwojone, prędkość maksymalna przy niezmienionym stężeniu substratu wzrośnie dwukrotnie. Przy S0 = 5*10-5 V0 = 15 µmol/l/min jest podwojona do V = 30 µmol/l/min przy podwojonym stężeniu enzymu. |
|---|
Szybkość reakcji mierzona ilością przemienionego związku w jednostce czasu w przeliczeniu na określoną ilość materiału badanego jest miarą aktywności enzymu wyrażoną w jednostkach aktywności, które są umowne i dowolnie ustalone przez autorów metod. Z tych względów dla 1 enzymu istnieje wiele jednostek i porównywanie wyników uzyskanych innymi metodami jest często trudne. Wprowadzono więc pojęcie Bezwzględnej Standardowej Międzynarodowej Jednostki Aktywności Enzymów [U]. Jest to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu (lub określonej jego częśći, tj. 1µmola odpowiednich grup chemicznych, np. w białkach lub wielocukrowcach) w ciągu 1 min, temp. 30oC i optymalnych warunkach. Zwykle stężenie enzymu podaje się w jednostkach / ml roztworu, ale przy oznaczaniu aktywności enzymów w cieczach biologicznych, obliczanie standardowych jednostek odnosi się do 1000 ml cieczy lub w mili jednostkach na 1 ml.
Nie zawsze jednak aktywność enzymatyczna enzymu oznaczona różnymi metodami i podana w [U] będzie jednakowa, gdyż różne jednostki są obliczane dla różnych temperatur – niekoniecznie dla 30oC. Ponadto może być stosowany inny substrat dla danego enzymu, np. substratami do oznaczania aktywności fosfatazy alkalicznej mogą być: beta-glicerofosforan, fenylofosforan, para-nitrofenylofosforan lub fosforan fenoloftaleiny.
Każdy z tych substratów jest rozkładany przez fosfatazę z różną szybkością co jest przyczyną poważnych rozbieżności.
Szybkość reakcji jest prawie zawsze
proporcjonalna do enzymu.
Jeśli więc stężenie enzymu zostanie
podwojone, prędkość maksymalna
przy niezmienionym stężeniu substratu
wzrośnie dwukrotnie.
Wprowadzono pojęcie Bezwzględnej
Standardowej Międzynarodowej
Jednostki Aktywności Enzymów [U].
Jest to taka ilość enzymu, która
w ciągu 1 min, 30oC i optym. warunkach.
Mol / (L*s) = Kat / L
1ymol – 1min – 30C – 1000ml
Vo = Vx S / Km+S
J.Bodańskiego – równoważna
jest 1 mg fosforu (31g/mol)
wyzwolonemu przez fosfatazę
w 100 ml surowicy z b-glicerofosforanu
w 60 min inkubacji w 37C.
[Wartości prawidłowe w surowicy]
- w J.B. [1,5- 4]
- w J. standad [8- 21,5]
J.King-Armstronga (1mg fenolu(94)
100ml s.z FenyloFosforanu w 15min)
[3,5- 13] [25- 92]
J.KLEINA (1 mg fenoloftal.(318) enzym, 30min)
[0,6- 4] [0,6- 4,2]
J. Bessey’a – równoważna jest
1 ymol ParaNitroFenolu uwolnionemu przez
enz.w 1000 ml surowicy w 1h inkubacji w 37C
z ParaNitroFenyloFosforanem. 1000/60=16,67 ymol
[0,8- 2,3] [13,5- 38]
Inwertaza – b-D-fruktozydaza (kl.hydrolaz,
rozszczepiających wiązanie b-glikozydowe
w zw. O-glikozylowych = hydroliza końcowych
nieredukujących reszt
b-D-frktofuranozydowych. (sachD-glu+D-fruk)
Rozpowszechniona jest u roś,
ale najlepsze preparaty to drożdże piwne
/piekarskie ^C. Jest en.wewnątrzkom.
Zasada oznacz.aktywn.INW.opiera się
na pomiarze C cukrów redukujących,
których ilość ^ w miarę działania enz.