BADANIE EKSPRESJI GENÓW

Możemy sprawdzić, czy gen ulega ekspresji, jeżeli:

- wykryjemy jego RNA

- wykryjemy konkretne jego białko

produktem ekspresji może być RNA lub ostatecznym – białko.

To, że mamy mRNA nie oznacza, że będzie białko!

Metody na poziomie kwasów nukleinowych (nimi wykrywamy kw. nukleinowe):

• RT-PCR

• Real-time PCR (PCR w czasie rzeczywistym

• Northern Blotting

• Wykorzystanie mikromacierzy DNA

Wstępny etap przy wszystkich tych metod: izolacja RNA.

Poza Northern Blotting, który bezpośrednio wykrywa RNA, wszystkie metody pozwalają pośrednio określić, czy powstało RNA – nie wykrywa RNA, tylko coś, co powstaje na RNA lub z jego pomocą.

RT-PCR Reverse Trascriptase – PCR

Reakcja odwrotnej transkryptazy jest połączona z reakcją PCR

Odwrotna transkryptaza – przepisanie z RNA na DNA (w przypadku wirusów)

Polimeraza DNA syntetyzuje DNA na matrycy DNA. Nie mają zdolności syntezy na matrycy RNA. Nie możemy użyć samego PCR, ponieważ PCR nie jest w stanie namnożyć RNA – najpierw trzeba przepisać na DNA i dopiero tę cząsteczkę DNA odpowiadającą RNA namnażamy i wykrywamy.

EUKARIOTYCZNE NA KONCU 3’ MAJA OGONEK POLI-A (prawie 100%)

mRNA cDNA (complementary) już ta jedna nić wystarcza, aby na niej przeprowadzić PCR

można zacząć jedną nicią, bo w pierwszym cyklu dorobi się druga nić i dalej będzie kopiowane już dwuniciowe.

Real-Time PCR

Reakcja PCr z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym stosowana jest do pomiaru ilościowego kopii genu, trans genu czy genów wirusowych i bakteryjnych lub poziomu ekspresji RNA w komórkach i tkankach

W trakcie cyklu obserwujemy przyrost produktu. To śledzenie pomaga określić ilość kopii DNA w probówce na wejściu (co jest analogiczne do ilości cząsteczek RNA)

Jest dużo bardziej dokładna od konwencjonalnego PCR

Wszystko dzieje się w oparciu o zjawisko fluorescencji.

Do metody tej opracowano interkalujące barwniki, np. bromek etydyny SYBR Green I

DNA pochłania światło UV, a następnie emituje światło o zupełnie innej długości fali tę falę pochłania bromek etydyny, który zostaje wzbudzony do świecenia światłem, które widzimy jako barwny produkt na żelu

Sondy hybrydyzujące (drugi sposób wykrywania przyrostu DNA)

• TaqMan

• Molecular Beacons

• HybProbes

Po każdym cyklu, jeżeli cząsteczek DNA jest więcej, to większa ilość barwnika jest w stanie interkalować, dlatego widzimy ‘więcej świecenia’.

Metody z użyciem sond FRET (fluorescence resonance energy transfer): HybProbes, Molecular Beacons, TaqMan dwa fluorochromy, są naprzemiennie wzbudzane I emitują światło (j.w.)

Detektor jest ustawiony tak, żeby wykrywać tylko ostateczną długość swiatła (przynajmniej w HybProbes)

Molecular BEacons – metoda sygnałów molekularnych – wyciszamy pierwszy sygnał (drugi fluorochrom, który pochłania to światło i emituje jakieś inne, jakiekolwiek, niewidzialne na detektorze – zadaniem drugiego fluorochromu jest wyciszenie pierwszego świecenia)

Taq Man – metoda hydrolizy sond

Pływa sobie sama sonda, emitowane światło jest wyciszane przez drugi fluor ochrom. Póki sonda jest niezniszczona, światło które jest emitowane nie jest nigdzie widoczne. Gdy dochodzi do wydłużania starterów polimeraza rozwala oligonukleotyd, uwalnia fluor ochrom, który przestrzennie się rozdziela z wyciszającym fluorochromem i zaczyna emitowac światło, które jest zbierane w detektorze – im więcej cząsteczek uwolnionych, tym więcej światła, tym więcej było matrycy.

ANALIZA ILOŚCIOWA:

Wyznacza się wartość progową fluorescencji (C_T) – moment, w którym kinetyka reakcji wchodzi w fazę logarytmicznego przyrostu produktu.

Im więcej kopii badanej sekwencji było w momencie rozpoczęcia reakcji, tym szybciej następuje C_T

Niezależnie od początkowej liczby matrycy po pewnej ilości cykli ilość produktu będzie we wszystkich próbkach taka sama, co wynika z faktu, że PCR w pewnym momencie nie może iść dalej z powodu np. zużycia materiału i innych czynników.

Northern Blotting

Umożliwia bezpośrednie wykrycie RNA – puszcza się RNA na żel (rozdział elektroforetyczny). Następuje rozdział, po przeniesieniu na nitrocelulozę robi się hybrydyzację (np. radioaktywną) i zbierać światło na kliszy RNa jest jeśli: specyficznie związało się z daną sondą, wielkość RNA (prążek na odpowiedniej wysokości, oczekiwanej wcześniej)

Wykorzystanie mikromacierzy DNA

Technika składa się z czterech etapów:

Przygotowanie sond molekularnych i ich immobilizacja na powierzchni płytki na powierzchni jest bardzo bardzo dużo sond, które lączą się z cDNA

Przygotowanie wyznakowanych próbek DNA przeznaczonych do analizy

Hybrydyzacji próbek DNA z sondami mikromacierzy

Odczytanie sygnałów uzyskanych z hybrydyzacji i analiza danych

Sondy molekularne mogą być oparte o cDNA, o DNA genomowe, oligonukleotydowe

Chip DNA – przeprowadzenie jednocześnie wielu elementów hybrydyzacyjnych.

Zalety: możliwość analizy ekspresji ….wielu genów jednocześnie?

TECHNIKI IMMUNOENZYMATYCZNE

1. Western Blot

2. Dot Blot

3. ELISA

4. Immunohistochemia

Western Blot dwa parametry: masa białka i swoiste wiązanie przeciwciała do danego białka

ELISA nie ma żadnych informacji o masie, jest tylko swoiste wykrycie białka

Sam SDS-PAGE tylko rozdzieli białka względem masy, czyli też tylko jeden parametr

Dot Blot – różnice względem Western Blot:

Z dołków materiał zostaje zassany na nitrocelulozę, która znajduje się pomiędzy kolejnymi częściami aparatu do DotBlota.

Dalej postępuje się jak w klasycznym western blottingu (blokowanie, reakcja z przeciwciałami, płukanie, detekcja)

Plusy: większa ilość próbek na raz.; transfer znacznie szybszy (5-10 sekund, a w WB – godzina);

Minusy: nie znamy wielkości białka.

ELISA

Plus: nie tylko analiza jakościowa, ale też ilościowa – po zbadaniu absprbancji jesteśmy w stanie określić, ile białka jest w próbce

W pozostałych metodach też istnieją aparaty do badania intensywności zabarwienia prążka, jednak nie należy to poklasycznych metod.

IMMUNOHISTOCHEMIA

Technika umożliwiająca zlokalizowanie białka w konkretnej tkance, konkretnych komórkach.

Jest inny nośnik – szkiełko mikroskopowe, do którego w jakiś sposób utrwalamy nasz materiał badawczy.

Na szkiełko nakraplamy przeciwciała, które związą się z szukanym białkiem (wczesniej blokowanie przeciw niespecyficznemu wiązaniu), odpłukanie, dodanie drugorzędowych przeciwciał związanych z jakimś enzymem lub od razu z fluorochromem.

PRZYGOTOWANIE MATERIAŁY DO REAKCJI

Pozyskanie materiały

Permeabilizacja błon komórkowych (łatwiejsze przenikanie przeciwciał przez błony)

Przygotowanie skrawków: parafinowych lub kriostatowych

Reakcje kontrolne:

dodatnie – na modelowej tkance, brak zabarwienia – błąd w preparacie

ujemna – z pominięciem swoistego znakowanego Ab, zabarwienie oznacza błąd w preparacie

ANCYLOSTOMA DUODENALE