W.Duszkiewicz-Reinhard, R.Grzybowski, E.Sobczak „Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej.”

Antoni Różalski „Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej.”

Sterylizacja, podstawowe wyposażenie pracowni mikrobiologicznej, przepisy BHP

Przepisy BHP

W sali mikrobiologicznej podstawowym zabezpieczeniem studenta jest fartuch, który student zobowiązany jest posiadać na każdych zajęciach bez wyjątku.

Mycie szkła laboratoryjnego

Zmywalnia zawierać powinna autoklaw- urządzenie przeznaczone do niszczenia (sterylizacji) materiału zakaźnego który został już przez nas wykorzystany. Zmywalnia powinna również zawierać zestaw do gotowania oraz stanowisko do mycia szkła laboratoryjnego. Zmywalnia składa się z dwóch stanowisk w których znajdować powinny się stanowisko do mycia za pomocą detergentów (mycie zwykłe) oraz drugie do mycia do mycia chemicznego (mycie za pomocą chromianki oraz Rovanexu). Szkło po umyciu powinno zostać poddane działaniu wody bieżącej a następnie płukane powinno być w wodzie destylowanej. Suszenie szkła odbywa się najczęściej w suszarkach elektrycznych , lub na powietrzu następnie jest ono przygotowywane do sterylizacji. Jeżeli szkło nie będzie sterylne dojdzie do zafałszowania wyników.

Sterylizacja:

Sterylizacja (wyjaławianie) jest to proces polegający na zabijaniu drobnoustrojów (ich komórek wegetatywnych, oraz form przetrwanych). Można ją przeprowadzić trzema metodami to znaczy: fizycznymi, chemicznymi oraz mechanicznymi.

1. Metody fizyczne:

Stosowanie wysokich temperatur :

Sterylizacja cieplna sucha

- wyżarzanie- jest to metoda polegająca na wyżarzaniu w płomieniu palnika gazowego ez do czerwonego żaru, służy ona do wyjaławiania ezy (drucika z oczkiem wykonanego z platyny lub ze stopu platyno-podobnego służącego do pobierania próbek bakteryjnych) oraz igieł preparacyjnych. Wyżarzanie stosowane jest przed i po szczepieniu pożywki drobnoustrojami.

- opalanie- (pokaż) jest to metoda polegająca na opalaniu w płomieniu palnika brzegów probówek oraz kolb (po wyjęciu korka). Stosowana jest ona w celu zapobieżenia zakażenia mikroorganizmami z zewnątrz. Wykorzystuje się ją również do opalania bagietek, głaszczek szklanych, szkiełek podstawowych podczas wykonywania preparatów mikroskopowych. Wymienione przedmioty jak również skalpele, łopatki metalowe, pensety, grube igły preparacyjne sterylizuje się również poprzez zanurzenie ich w alkoholu etylowym i opalaniu w płomieniu palnika.

- suszenie- metoda ta służy do wyjaławiania szkła laboratoryjnego, trwałych materiałów oraz wszelkiego rodzaju przedmiotów stalowych (opraw metalowych do filtrów, cylinderków do badania wrażliwości na antybiotyki, kuleczek szklanych oraz materiałów sypkich. Metoda ta wykorzystywana jest do sterylizowania w temperaturze 140 ^o C przez 2,5 h, 160^o C przez 2h, oraz 180^o C przez 1h. Materiały do sterylizacji powinny być odpowiednio przygotowane tzn. probówki zakryte powinny być korkami z waty, ligniny lub metalowymi, kolby korkami ligninowymi lub tzw. `kołderkami' i kawałkami folii aluminiowej. Płytki Petriego, pipety zawijane powinny być w papier lub umieszczone powinny być w metalowych puszkach oraz w tubusach. Ustniki pipet zabezpieczone natomiast muszą być wacikami.

Sterylizacja cieplna mokra (metoda fizyczna z użyciem wysokiej temperatury)

- dekoktacja- dawniej podczas sterylizacji wykorzystywano temperaturę wrzenia. We wrzącej wodzie umieszczano strzykawki, igły iniekcyjne, instrumenty chirurgiczne w szczelnie zamkniętych sterylizatorach elektrycznych lub zwykłych (podgrzewanych na maszynkach elektrycznych lub płomieniem palnika gazowego) Obecnie ta metoda ograniczona jest jedynie do wyjątkowych przypadków, ponieważ nie niszczy ona wirusów zapalenia wątroby, oraz przetrwalników bakterii. Podczas stosowania tej metody pamiętać należy o używaniu wody destylowanej (w szczególnych przypadkach wody przegotowanej) ponieważ gotowanie w wodzie wodociągowej pozostawia nalot na strzykawkach lub wewnątrz igieł.

- pasteryzacja- metoda nie używana w mikrobiologii- działanie na drobnoustroje temperaturą do 100^o C uznawane jest za pasteryzację, temperatura powyżej 100^o C nazywana jest sterylizacją. Proces pasteryzacji polega na niszczeniu form wegetatywnych drobnoustrojów występujących w środowiskach płynnych (tj. produkty spożywcze: mleko, przetworach mlecznych, piwie, sokach itp.). Pasteryzacja ma na celu zabijanie bakterii chorobotwórczych w produktach spożywczych oraz przedłużanie trwałości produktów spożywczych w wyniku zabijania większości drobnoustrojów saprofitycznych nieprzetrwalnikujących. Wyróżnić możemy pasteryzację niską (długotrwałą)- polegająca na ogrzewaniu produktów do temperatury 63-65^o C przez 30 min., oraz pasteryzacje wysoką (szybką)- podczas której pasteryzowany płyn cienka warstwą przez specjalny aparat, ogrzewany jest w ciągu 15 sekund do 72^o C (lub do 90^o C bez zatrzymywania w aparacie). Najnowszą technologia pasteryzacji jest stosowanie obróbki termicznej UHT (Ultra High Temperature)- temperatura `ultrawysoka'. Technologia ta pozwala na pełną sterylizację mleka. W metodzie UHT wyróżnić można pasteryzacje szybka HTST (High Temperature Short Time-wysoka temperatura, krótki czas) oraz tzw. ultraszybką- tzw. rzeczywista pasteryzacja UHT. Obie te metody umożliwiają uzyskanie mleka o przedłużonej trwałości- wolnego (poza niektórymi szczepami ) od bakterii psychrotrofowych (zdolnych do wzrostu w niskich temperaturach). We właściwej technologii UHT stosuje się temperaturę 130-150^o C przez kilka sekund (dla mleka nie opakowanego). Efektem takich działań jest otrzymanie mleka jałowego, ze zinaktywowanymi wirusami pryszczycy. Do przetwarzania w tej technologii używane jest mleko o bardzo wysokiej czystości mikrobiologicznej, bez enzymów bakteryjnych. Metoda ta prowadzi do koagulacji białek mleka, gorzknienia mleka i jego częściowego rozkładu. Każda pasteryzacja kończy się gwałtownym schłodzeniem produktu, aby nie stracił on swoich wartości odżywczych.

- tyndalizacja w aparacie Kocha- (metoda cieplna mokra) aparat Kocha używany jest podczas sterylizacji w bieżącej parze wodnej podłoży mikrobiologicznych, których skład nie pozwala na wyjaławianie w temperaturze ponad 100^o C. Jest to zamykany pokrywą kocioł z podwójnym dnem na spodzie którego znajduje się zbiornik z wodą podgrzewaną do temperatury wrzenia. Gorąca para wodna (nasycona, bez powietrza) ulatnia się przez otwory w dnie z w którym ustawia się kolby z jałowymi podłożami. Sterylizacja w 100^o C przez 30 min usuwa jedynie formy wegetatywne drobnoustrojów. Aby usunąć całkowity zasób drobnoustrojów przeprowadza się w aparacie Kocha tyndalizację. Tyndalizacja polega na trzykrotnej pasteryzacji w odstępach 24 godzin. W przerwach pomiędzy wyjaławianiem pożywki umieszcza się w cieplarce w temperaturze 32^o C. Po pierwszym wyjałowieniu zabijane są formy wegetatywne, pozostają jednak formy przetrwalnikowe które kiełkują w czasie inkubacji pożywki w cieplarce. Pochodzące z nich formy wegetatywne zostają zabite podczas następnej sterylizacji. Trzecie wyjałowienie poprzedzone inkubacją w temp. 32^o C zapewnia pełną skuteczność procesu.

Termostat- jest to urządzenie utrzymujące stałą temperaturę.

Suszarka- służy do suszenia sprzętu laboratoryjnego (czyli wyjaławiania go).

- wyjaławianie za pomocą pary wodnej pod zwiększonym ciśnieniem- ten typ sterylizacji prowadzony jest w autoklawie (zabijanie starych hodowli) lub szybkowarze gdzie można uzyskać temperaturę powyżej 100^o C. Ten rodzaj sterylizacji stosowany może być wyłącznie do wyjaławiania materiałów, lub płynów których składniki nie ulegają rozkładowi w temperaturze powyżej 100^o C. Autoklaw jest to urządzenie pracujące pod ciśnieniem. Działanie autoklawu polega na sterylizacji wysoka temperaturą uzyskana po sprężeniu nasyconej pary wodnej. Para ta w zetknięciu z chłodniejszymi przedmiotami które są wyjaławiane skrapla się w postaci wody, uwalniając dużą ilość utajonego ciepła kondensacji, które podnosi temperaturę sterylizacji. Jest więc ona zależna od ciśnienia pod warunkiem jednak iż autoklaw przed zamknięciem zostanie całkowicie odpowietrzony. Poddanie sprężaniu mieszaniny pary wodnej i powietrza powoduje uzyskanie niższej temperatury tak więc obniża skuteczność sterylizacji. Najczęściej stosuje się nadciśnienie 0,8-1,6 atmosfery co odpowiada temperaturze 117,0-127,0^o C. Jeżeli chodzi o czas to im wyższa temperatura sterylizacji tym krótszy czas wyjaławiania. Czas sterylizacji zależy również od objętości pożywek w kolbach- im mniejsza ich objętość, tym krótszy czas wyjaławiania. Podczas wyżej wymienionych warunków czas wystarczający do zabicia wszystkich bakterii, komórek wegetatywnych oraz form przetrwalnych waha się od 60 do 20-30 minut. Autoklaw działa w zakresach : 0,5 A-112^oC; 0,75 A-117^oC; 1 A-121^oC; 1,5 A-128^oC.

Szybkowary używane są do wyjaławiania małych ilości pożywek.

Przyczyną śmierci drobnoustrojów w wyniku sterylizacji są zmiany chemiczne w białkach oraz zniszczenie struktury błony komórkowej. W wysokiej temperaturze w suchych warunkach białka ulegają utlenieniu, podczas obecności wody i w niższej temperaturze białka koagulują. Odkładając na osi rzędnych wartość czasu, a na osi odciętych wartość temperatury, w której ma miejsce śmierć wszystkich komórek danej populacji bakteryjnej w danym środowisku otrzymujemy krzywą śmierci cieplnej drobnoustrojów (krzywa TDT -thermal death time curve). Każdy jej punkt informuje o minimalnym czasie potrzebnym do zabicia populacji danego gatunku drobnoustrojów w konkretnej temperaturze i odwrotnie- jaka minimalna temperatura potrzebna jest do tego aby zniszczyć populację w określonym czasie. Krzywa ta pozwala również na określenie wartości czasu śmierci cieplnej w temperaturze odniesienia- 65,6^oC podczas pasteryzacji, 121,0^oC podczas sterylizacji. Czas śmierci cieplnej oznaczany jest literą F, a jego wartość dla drobnoustrojów podaje się w minutach. Kolejnym parametrem sterylizacji jest wartość informująca o względnej ciepłooporności drobnoustrojów- współczynnik ciepłooporności drobnoustrojów. Jego wartość charakteryzowana jest przez nachylenie krzywej TDT. Podczas sporządzania krzywej TDT zakładamy iż śmierć drobnoustrojów następuje określonym czasie i temperaturze. Jednakże komórki giną w pewnym przedziale czasowym. Najpierw te najsłabsze, potem bardziej oporne. Jest to powód dla którego podczas sterylizacji stosuje się stałą temperaturę przez określony czas. W tym czasie wzrasta ilość komórek wymierających, a w tej samej jednostce czasu wymiera ten sam procent drobnoustrojów. Redukcja liczby drobnoustrojów o 90% określana jest również jako redukcja o jeden cykl logarytmiczny, czyli decymalna redukcja liczby drobnoustrojów (D). D=1 jest to spadek ilości drobnoustrojów o 90 %, D=2 o 99%, D=3 o 99,9%. Wartość D wyznaczamy sporządzając tzw. krzywa przeżycia drobnoustrojów podczas wyjaławiania- obrazuje ona zależność liczby drobnoustrojów od czasu sterylizacji w danej temperaturze (istnieją takie warunki temperaturowo-czasowe w których wystąpi śmierć całej populacji drobnoustrojów. Im dłuższy proces wyjaławiania tym mniejsza liczba komórek drobnoustrojów (maleje ona w nieskończoność). Tak więc im większa ilość komórek drobnoustrojów w wyjaławianym materiale tym dłuższy czas jest potrzebny do uzyskania określonej wartości D.

- działanie promieniowania ultrafioletowego i ultradźwięków- (metoda fizyczna) promieniowanie elektromagnetyczne obejmuje ultrakrótkie promienie kosmiczne, promienie X oraz UV, widzialną część światła słonecznego do podczerwieni i długich fal radiowych. U podstaw działania każdego z tych rodzajów promieniowania leży zjawisko jego pochłaniania przez substancje chemiczne komórki. Pochłanianie to jest wybiórcze o określonej długości fali. W zależności od dawki oraz czasu działania promieniowania na drobnoustroje obserwuje się efekt mutagenny (komórka ulega mutacji) lub letalny (śmierć komórki).

Najsłabiej na drobnoustroje działa światło widzialne, a wrażliwość na jego działanie zwiększają barwniki błękit metylenowy oraz eozyna- na bakterie Gram + i safranina na Gram- . Bakteriobójcze działanie światła widzialnego w obecności wyżej wymienionych barwników polega na zjawisku fotosensytyzacji (fotouczuleniu)- fotoutlenianie. Podobnie do barwników syntetycznych działają barwniki- wytwarzane w komórkach bakterii (np. koenzymy z grupą porfirynową). Najsilniejsze działanie bakteriobójcze wykazuje promieniowanie UV, oraz promieniowanie jonizujące.

Promieniowanie UV o zakresie fal 230-270 nm wykazuje niezwykle silne działanie bakteriobójcze lub mutagenne. W szczególności promieniowanie o długości 260 nm jest pochłaniane w komórkach bakteryjnych przez zasady purynowe i pirymidynowe DNA oraz aminokwasy aromatyczne białek. Najwrażliwsze na jego działanie są formy wegetatywne. Przetrwalniki (endo- egzospory)oraz wirusy są oporniejsze. Najbardziej wrażliwe na promienie UV są bakterie w fazie logarytmicznego wzrostu. Efekt letalny bakterii warunkowany jest powstawaniem dimerów pomiędzy resztami tyminy w tej samej nici DNA co prowadzi do zaburzeń w jego replikacji. Działanie mutagenne to tworzenie się dimerów cytozyny oraz cytozyny i tyminy.

Bakterie posiadają dwa mechanizmy obronne- umożliwiające im naprawę uszkodzonego DNA: reperację świetlną (fotoreaktywacja) i reperację ciemną. Pierwsze polega na rozszczepieniu powstałych dimerów tyminy przy udziale enzymu fotolizazy uaktywnianej światłem widzialnym. Reperacja ciemna to rozpoznanie i wycięcie uszkodzonych odcinków DNA usunięcie ich, zastąpienie nowym odcinkiem i połączenie w całość nici DNA.

Promieniowanie UV stosowane jest do sterylizacji powietrza i pomieszczeń. Źródłem promieniowania UV są lampy kwarcowe. Na efektywność tego rodzaju wyjaławiania mają wpływ trzy składowe: zapylenie i wilgotność powietrza, oraz czas napromieniowania.

- promienie jonizujące- sterylizacja radiacyjna niszczy drobnoustroje za pomocą promieniowania jonizującego (przenikliwego). Najsilniejsze działanie bakteriobójcze wykazują promienie X, γ-gamma oraz katodowe (strumienie szybkich elektronów-promieniowanie β). Dawka sterylizująca to 1-3 megarady. Mechanizm działania promieniowania jonizującego na bakterie wyjaśniają dwie teorie- teoria tarczy i działania pośredniego. Pierwsza zakłada działanie bezpośrednie prowadzące do trwałego zniszczenia DNA. Druga zaś wskazuje na możliwe działanie produktów radiolizy wody mające miejsce podczas naświetlania promieniowaniem jonizującym.

Źródłem tego promieniowania są izotopy- kobalt 60 i akceleratory elektronów. Tego rodzaju sterylizacji poddaje się najczęściej sprzęt medyczny jednorazowego użytku wykonywane z tworzyw sztucznych i metali, protezy biologiczne, materiały opatrunkowe, nici katgut (nić chirurgiczna zrobiona z jelita), produkty żywnościowe, leki i inne.

Metody chemiczne- sterylizacja gazowa

Jest to metoda stosowana na skalę przemysłową do wyjaławiania produktów jednorazowego użytku. Spośród gazów używa się tlenku etylenu- ponieważ jest to gaz wybuchowy stosuje się go w mieszaninie z CO₂. Tlenek etylenu mieszany jest również z parami formaldehydu lub bromku metylowego. Efektywność tej metody wzrasta podczas podwyższonej temperatury otoczenia. Tlenek etylenu działa bakteriobójczo na wszystkie drobnoustroje oraz ich formy przetrwalne. Gaz ten jest trucizną protoplazmatyczną, alkiluje on grupy funkcyjne karboksylowe, aminowe, fenylowe orz sulfhydrylowe w białkach bakterii. Podczas sterylizacji gazowej rzadziej stosuje się β-propiolakton. Tego typu sterylizacja jest niezwykle toksyczna i wymaga ciągłego nadzoru.

Metody mechaniczne- filtracja

Niektóre pożywki, bufory, płyny ustrojowe i roztwory nie mogą być wyjaławiane termicznie, gdyż ich składniki ulegają zniszczeniu w wysokiej temperaturze. W takim przypadku stosuje się sączenie przez filtry o średnicy porów mniejszej od średnicy bakterii (0,2-0,45 μm- jeden mikrometr to jedna tysięczna metra). W takich warunkach płyn przemieszcza się wolno dlatego należy stosować podciśnienie(pompka wodna, lub pompa olejowa) lub nadciśnienie (filtry strzykawkowe- maleńkie zatopione w plastiku). Filtry mikrobiologiczne działają również na zasadzie adsorpcji cząstek sączonych na ścianach porów. Skuteczność sączenia mikrobiologicznego zależy również od ładunku elektrycznego bakterii, budowy powierzchni oraz powierzchni porów filtrów.

Zestaw do sączenia składa się z kolby próżniowej, na której umieszcza się filtr bakteriologiczny. Całość zabezpiecza się prze dostaniem się drobnoustrojów z zewnątrz i sterylizuje w autoklawie lub suszarce. Zestaw podłącza się do pompy próżniowej, poprzedzonej płuczką. Najczęściej do sączenia używane są filtry membranowe (bardzo mała średnica porów). W praktyce stosuje się jednak sączki z nitrocelulozy lub octanu celulozy (mogą być sterylizowane w autoklawie). Ta metoda wyjaławiane są np. leki, enzymy i inne. Służy do ustalania ilości komórek bakteryjnych. Filtr Szota- ze spiekanego szkła.

Kontrola sterylizacji

Sprawdzanie skuteczności procesu sterylizacji jest niezwykle istotną częścią pracy w laboratorium. Stosuje się do tego specjalne sporo testy- Sporal A i S. Pierwszy służy do sprawdzania autoklawów, drugi do suszarek. Preparaty te zawierają pewne ilości przetrwalników Bacillus stearothermophilus- sporal A, Bacillus subtilis- sporal S zaadsorbowane na krążku bibułowym. Testy umieszcza się we wnętrzu autoklawu, suszarki lub w wyjaławianym sprzęcie. Po zakończeniu sterylizacji krążek wkłada się do bulionu cukrowego i inkubuje w temperaturze 55^o C (optymalna dla wzrostu bakterii) przez 48h. Wynik dodatni czyli wzrost bakterii świadczy o nieprawidłowej pracy urządzenia.

Dezynfekcja

Dezynfekcja (odkażanie) jest procesem który prowadzi do zabicia drobnoustrojów chorobotwórczych oraz do zmniejszenia zanieczyszczenia innymi drobnoustrojami w danym środowisku. Jest to selektywna eliminacja drobnoustrojów, zapobiegająca przenoszeniu niektórych niepożądanych mikroorganizmów, przez działanie na ich strukturę lub metabolizm niezależnie od ich funkcjonalnej postaci. Różnica pomiędzy sterylizacją a dezynfekcją polega na rodzaju środków oraz spektrum mikroorganizmów eliminowanych podczas działania na nie środkami. Podczas dezynfekcji stosuje się środki chemiczne, prowadzi to do usunięcia wegetatywnych form drobnoustrojów, podczas gdy sterylizacja usuwa wszelkie formy życia drobnoustrojów (wegetatywne, przetrwalne).

Jedną z odmian dezynfekcji jest dekoktacja oraz działanie UV. Z dezynfekcją wiążą się następujące pojęcia: sanityzacja, aseptyka, antyseptyka. Sanityzacja to mycie przy pomocy detergentów pomieszczeń i ich wyposażenia narażonych na silne zanieczyszczenie drobnoustrojami. Prowadzi to do obniżenia zanieczyszczenia drobnoustrojami oraz zwiększa skuteczność właściwej dezynfekcji. Aseptyka to jałowe przygotowanie leków lub produktów medycznych. Antyseptyka to z kolei postępowanie prowadzące do usunięcia drobnoustrojów ze skóry, błon śluzowych, tkanek. Stosuje się tu wyłącznie nietoksyczne środki dezynfekujące, które nie podrażniają i nie uszkadzają tkanek. Do chemicznych środków dezynfekcyjnych należą: kwasy i zasady, związki chloru (środki utleniające), alkohole, aldehydy, związki fenolowe i ich pochodne, czwartorzędowe związki amoniowe (detergenty)- związki powierzchniowo czynne, sole metali ciężkich, jodofory oraz chloroheksydyna.

Wymaganiami które muszą być spełniane przez środki dezynfekcyjne są:

-skuteczność,

-działanie w małym stężeniu, w krótkim czasie w temperaturze otoczenia,

-nie wpływanie ujemnie na żywność,

-nie niszczenie dezynfekowanych urządzeń,

-substancje chemiczne stanowiące środek dezynfekcyjny nie stanowią zagrożenia dla ludzi,

-są łatwo spłukiwane wodą,

-brak jest nieprzyjemnego zapachu,

-szerokie spektrum działania na drobnoustroje,

-taniość.

Na efektywność działania środków dezynfekcyjnych mają wpływ: czas stosowania, stężenie, temperatura, pH, wilgotność środowiska i obecność substancji organicznych w otoczeniu. Im dłuższy czas działania i im wyższa temperatura otoczenie tym skuteczniejsza jest dezynfekcja. Duża zawartość substancji organicznych w powietrzu znacznie obniża skuteczność procesu dezynfekcji.

Podłoże mikrobiologiczne to sztucznie stworzone środowisko wzrostu dohodowali drobnoustrojów. Stosowane jest do izolacji, różnicowania, identyfikacji, lub namnażania drobnoustrojów. Określania ich właściwości fizjologicznych, biochemicznych oraz hodowlanych, lub tez do otrzymywania konkretnych produktów ich metabolizmu.

Cechy dobrego podłoża:

-łatwo dostępne źródła pierwiastków biogennych(C, O, H, N, P, S) oraz energii, odpowiedni zestaw soli mineralnych,

-optymalne dla wzrostu poszczególnych typów drobnoustrojów pH (lekko zasadowe 7,2-7,4 dla bakterii; dla grzybów kwaśne 5,5-6,5) oraz potencjał red-oks,

-musza być przejrzyste, z wyjątkiem podłoży zawierających związki nierozpuszczalne np. tłuszcze,

-muszą mieć odpowiednią wartość ciśnienia osmotycznego, zmienić można ją poprzez dodanie chlorku sodowego; izotoniczne- takie jak w komórce; hipertoniczne- woda jest tu odciągana; hipotoniczne-woda napływa do komórki.

-muszą być jałowe, bez czynnego materiału genetycznego np. plazmidów

Rodzaje podłóż:

* Podział ze względu na konsystencję

- płynne- służą do namnażania drobnoustrojów

- półpłynne- 0,1-0,7% agaru (uniwersalny mikrobiologiczny czynnik zestalający pożywki, nierozkładany przez większość bakterii, otrzymywany z morskich krasnorostów- Rhodophyta- z ich ścian komórkowych, składa się w 70% z agarozy i agaropektyny; do zestalania używana jest również żelatyna-nierozpuszczalna na zimno, pęcznieje w wodzie gorącej i zastyga, upłynnia się w temp. 22-25^o C, używana do badania wytwarzania przez bakterie żelatynazy- enzymu hydrolizującego żelatynę; lub rzadko stosowany żel krzemionkowy-do przygotowywania pożywek stałych bez składników organicznych; agar rozpuszcza się w wodzi w temperaturze 100^o C, stygnie w 45^o C w pH obojętnym, w pH niskim nie krzepnie), służą do badania ruchów bakterii (rzęski bakterii)

- stałe- 1,5-2% agaru, służą do namnażania i różnicowania bakterii

* Podział ze względu na skład i zastosowanie

- podłoża minimalne- ich odmianą są podłoża transportowe- zawierają tylko składniki pokarmowe niezbędne do podtrzymania wzrostu drobnoustrojów (wg Adamsa). Służą do hodowli autotrofów. Dla porównania pożywki dla heterotrofów zawierają najczęściej wyciągi z tkanek (mięsa wołowego, końskiego, wyciągi z serc, wątroby, mózgu). Niektóre heterotrofy - prototrofy zdolne są do wzrostu na podłożach zawierających jedynie proste substancje oraz sole mineralne. Auksotrofy natomiast wymagają obecności aminokwasów, zasad purynowych i pirymidynowych, witamin, czynników wzrostowych- wyciąg z drożdży pomidorów, lub ziemniaków. Transportowe- to szczególna grupa podłóż zabezpieczających materiał badany podczas transportu, są to podłoża dobrze zbuforowane minimalne, bez składników odżywczych, zawierające jedynie sole mineralne.

- podłoża pełne/podstawowe/zwykłe- zawierają wszystkie niezbędne substancje odżywcze służące do bakteryjnego wzrostu (C, N, sole mineralne, czynniki wzrostowe)- bulion (wyciąg mięsny) odżywczy dla bakterii, brzeczka do hodowli drożdży. Wykorzystywane są one do produkcji podłóż specjalnych.

- podłoża wzbogacone

* Podział ze względu na zastosowanie:

Podłoża złożone specjalne:

wzbogacone- dla drobnoustrojów słabo rosnących in-vitro, wymagających dodatkowych substancji odżywczych (np. krew- pochodzenie naturalne, krew końska lub owcza 3-5% np. dla pałeczki grypowej, surowica, mleko, żółtka jaj i inne) używane dla wzrostu drobnoustrojów chorobotwórczych; podłoża bogate w substancje organiczne wymagane są dla bakterii heterotroficznych w szczególności auksotrofów, używane dla bakterii wybrednych, pasożytniczych

namnażające- w postaci płynnej, skosów agarowych, płytek, butli Roux służą do badania dużej biomasy danego szczepu bakterii,

selektywne (wybiórcze)- z dodatkiem związków chemicznych hamujących wzrost konkretnej grupy drobnoustrojów, (np. chlorek sodowy 7,5 do Chapmana dla gronkowców)

wybiórczo namnażające- pozwalają na namnożenie tylko jednemu rodzajowi lub gatunkowi drobnoustrojów, lub jednej grupie mikroorganizmów z posianego materiału. Zawierają one czynniki hamujące wzrost jednych bakterii i zapewniające wzrost innym drobnoustrojom, np. podłoże bezazotowe z mannitolem dla hodowli bakterii wiążących azot atmosferyczny- Azotobacter sp., podłoże z kwaśnym seleninem sodu hamujące wzrost E.coli, oraz do namnażania Salmonella sp. z kału lub żywności, podłoże Kauffmana z czterotionianem sodowym i żółcią hamujące wzrost bakterii kałowych z wyjątkiem Salmonella sp.,

izolacyjne- są to płytki, zawierające odpowiedni identyfikator-wskaźnik pozwalający odróżnić od siebie pewne gatunki bakterii, np. podłoże Chapmana z mannitolem do hodowli gronkowców, płytka Endo z laktozą do diagnostyki Enterobacteriaceae, podłoże Clauberga z tellurynempotasu do hodowli Corynebacterium sp.,

różnicujące- identyfikacyjne diagnostyczne, są to podłoża wybiórcze, różnicują one bakterie pod względem określonej cechy (pożywki Endo, Mckonkeya), używane są tu barwniki np. fuksyna która w zależności od bakterii i jej działania zmienia kolor lub nie

* Podział ze względu na pochodzenie składników

- naturalne- składniki zawarte w nich są naturalnego pochodzenia (mleko, ziemniaki),

- półsyntetyczne- np. wg Adamsa z glukozą i autolizatem drożdży dla np. Escherichia,

- syntetyczne- np. z mannitolem do hodowli Azotobacter, do hodowli nitryfikatorów lub mutantów auksotroficznych.

1

---