Laboratorium „Inżynieria bioreaktorów” dla kierunku „Biotechnologia”

Prowadzący: dr. hab. Jolanta Bryjak

Mgr inż. Marta Bochno

Reaktory przepływowe - kolumna ze złożem upakowanym

Wyznaczanie stałych równania kinetycznego reakcji izomeryzacji D-glukozy do D-fruktozy

Cel ćwiczenia: zapoznanie się z procedurą postępowania przy wyznaczaniu stałych równania kinetycznego reakcji równowagowej; prowadzenie procesu w kolumnie ze złożem upakowanym z immobilizowaną izomerazą glukozową

Izomeryzacja glukoza↔fruktoza

Reakcja enzymatycznej izomeryzacji D-glukozy jest przykładem reakcji równowagowej, w której enzym wykazuje powinowactwo zarówno do substratu, jak i produktu reakcji. Reakcję izomeryzacji glukozy (G) i fruktozy (F) przedstawia schemat (1), który, przy założeniu, że szybkości przekształcania kompleksów aktywnych (GE ⇔ GF) są bardzo duże upraszcza się do schematu (2).

G + E ⇔ GE ⇔ GF ⇔ F + E (1)

G + E ⇔ GE ⇔ F + E (2)

W badaniach kinetycznych szybkość reakcji w obecności różnych początkowych stężeń substratu mierzona jest zazwyczaj w bardzo wczesnym stadium reakcji, zanim stężenie produktu wzrośnie do znaczącego poziomu (stopień przereagowania substratu < 3%). Przy spełnieniu tego warunku, można wyznaczyć parametry kinetyczne reakcji zarówno w kierunku G→F, jak i F→G, stosując odpowiednie równania Michaelisa-Menten:

G→F:


(3)

F→G:

(4)

gdzie: V_maxG, V_maxF - stałe szybkości reakcji dla glukozy lub fruktozy jako substratu;

K_mG, K_mF - stałe Michaelisa dla glukozy lub fruktozy jako substratu

Rozpatrując przebieg procesu izomeryzacji, należy wziąć pod uwagę fakt obecności substratu i produktu reakcji w mieszaninie reakcyjnej, co m. in. pozwala oszacować kierunek przebiegu reakcji. Kierunek reakcji zależy od relacji między stosunkiem C_F / C_G a stosunkiem równowagowym (K_eq). Np., jeżeli K_eq = 1, C_F = 5 mM i C_G = 1 mM, to reakcja będzie przebiegać w kierunku F→G i osiągnie stan równowagi termodynamicznej dla C_F* = 3 mM i C_G* = 3 mM (C_F*,C_G* - stężenie glukozy i fruktozy w stanie równowagi termodynamicznej). Natomiast szybkość reakcji (r) dla danych wartości C_F i C_G nie może być policzona jako różnica szybkości reakcji r = r_G - r_F z równań (1) i (2), gdyż równania te oparte są na założeniu, że, odpowiednio, C_F lub C_G są równe zero. W takim przypadku należy zastosować równanie uwzględniające wpływ obu reagentów, tzn. w miarę postępu reakcji obniżające się wysycenie enzymu substratem i wzrastający udział reakcji w kierunku przeciwnym. Jeżeli założymy, że część enzymu nie jest dostępna dla substratu, gdyż reaguje z produktem, to możemy to zjawisko przybliżyć modelem przewidzianym dla inhibicji kompetycyjnej. Wówczas:

G→F:
(5)

F→G:
(6)

a szybkość reakcji np. w kierunku G→F: r = r_G - r_F (7)

Po przekształceniach algebraicznych równanie (7) przyjmuje postać:

(8)

W równaniu (8) 4 stałe kinetyczne ze stałą równowagi K_eq wiąże równanie Haldana:

K_eq = C_F* / C_G* =
(9)

Powyższe równanie ma bardzo duże znaczenie praktyczne. Między innymi służy do szybkiej weryfikacji poprawności wyznaczonych stałych z uproszczonych równań (3) i (4). Jeżeli dysponuje się doświadczalnie wyznaczoną wartością K_eq, to można ją porównać z wartością obliczoną na podstawie równania Haldana. Różnica między wartością eksperymentalną i obliczoną ze stałych równań kinetycznych rzędu błędu analitycznego pozwala stwierdzić poprawność wyznaczonych wartości stałych.

MATERIAŁY I METODY

Materiały

• immobilizowana izomeraza glukozowa (poprawnie: izomeraza ksylozowa) otrzymana nieodpłatnie z firmy Novozyme;

- objętość całkowita złoża - 20 cm³

- objętość wolna reaktora - 6.8 cm³

- temperatura procesu - 40° C

• roztwory glukozy i fruktozy;

• 0.05 M bufor tris-HCl + 3 mmol Mg, pH 7.8 w 40 °C;

• odczynniki do enzymatycznego oznaczania stężenia glukozy

Aparatura

• spektrofotometr UV-VIS Shimadzu;

• termostatowane reaktory kolumnowe

• pompy tłokowe Prominent

Metody

Oznaczanie stężenia glukozy testem enzymatycznym.

Zasada metody. Glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej utlenia się do kwasu glukonowego z wytworzeniem nadtlenku wodoru, który w obecności peroksydazy powoduje zmianę zabarwienia chromogenu.

Oznaczanie stężenia glukozy. Do suchych i czystych probówek wprowadzić po 1 cm³ roztworu roboczego. Przygotować również 2 probówki na standard glukozy i kontrolę. Z probówek zawierających odpowiednio rozcieńczone próbki badane oraz z próbki zawierającej standard pobrać po 10 μl roztworu i wprowadzić do roztworów roboczych. Każdorazowo kilkakrotnie przepłukać końcówkę roztworem roboczym. Całość wstawić na 5 min do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie zmierzyć absorbancję (500 nm) wobec próby kontrolnej.

Obliczanie stężenia glukozy. Wartość absorbancji dla standardu glukozy przyjąć jako 15 mmol/L. Z proporcji obliczyć stężenie w próbkach badanych, uwzględniając rozcieńczenie.

Rozcieńczenia. W przypadku fruktozy, jako substratu, pobranych próbek nie rozcieńczać. Stosując jako substrat glukozę, należy wykonać rozcieńczenia:

Stężenie glukozy [mM]	Rozcieńczenie [-]	Objętość roztworu badanego [μl]	Objętość wody [ml]
50	2x	1000	1,0
100	3x	1000	2,0
200	10x	1000	9,0
400	20x	500	9,5
600	20x	500	9,5
800	40x	250	9,75
1000	40x	250	9,75
1250	50x	200	9,8
1500	50x	200	9,8
1750	100x	100	9,9

Wyznaczanie wartości K_eq reakcji izomeryzacji.

Do 5 cm³ 0,05 M roztworu glukozy dodać 50 μl natywnej izomerazy glukozowej i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C celem osiągnięcia stanu równowagi termodynamicznej. Zadaniem każdej grupy jest pobranie próbki z wyjściowego roztworu substratu oraz z mieszaniny reakcyjnej, rozcieńczeniu próbek wodą destylowaną (podane w tabeli) oraz oznaczenie stężenie glukozy metodą enzymatyczną.

Pomiar zmiany stężeń reagentów w warunkach początkowej szybkości reakcji.

Przygotować po 500 cm³ dwóch roztworów glukozy lub fruktozy o podanych przez osobę prowadzącą stężeniach. Do termostatowanych (40°C) reaktorów kolumnowych ze złożem upakowanym dozować substrat z podanymi szybkościami przepływu (pompa „mała” - 60/120; 40/120; 20/120; 10/120 / pompa „duża” - 15/120; 7,5/120; 2,5/120; 0/120). Dla każdego przepływu zmierzyć strumień (zmierzyć czas napełnienia cylindra na 50 cm³), a następnie pobrać próbkę do analiz z wylotu z reaktora, zwracając uwagę na osiągnięcie stanu ustalonego. Należy również pobrać próbkę substratu na wejściu reaktora. Wszystkie próbki odpowiednio rozcieńczyć i oznaczyć stężenie glukozy testem enzymatycznym.

WYNIKI I ICH OMÓWIENIE

Na podstawie otrzymanych wyników obliczyć dla enzymu immobilizowanego:

• V_maxG, V_maxF , K_mG, K_mF i przedstawić analizę otrzymanych wyników;

• obliczyć stałą równowagi K_eq z otrzymanych wartości stałych równania kinetycznego i porównać z wartością K_eq, wyznaczoną eksperymentalnie.

Sprawozdanie winno zawierać: (1) wstęp (np. o enzymie, jego wykorzystaniu w przemyśle, ale przede wszystkim o reaktorze ze złożem upakowanym z immobilizowanym enzymem); (2) metodykę (należy pamiętać o formie bezosobowej np. dodano, zmierzono...); (3) przedstawienie wyników i ich dyskusję (podstawowe obliczenia powinny być zamieszczone w sprawozdaniu na wybranym przykładzie; jeżli pozostałe wyniki były liczone identycznie, resztę można przedstawić w tabelach/wykresach zbiorczych).

ZAGADNIENIA DO WEJŚCIÓWKI:

1. Równanie bilansowe dla reaktora przepływowego (wzór z oznaczeniami co jest co).

2. Szybkość reakcji w reaktorze przepływowym (wzór z oznaczeniami co jest co).

3. Definicja stanu ustalonego.

4. Czas przebywania (wzór z oznaczeniami co jest co)..

Uwaga! Enzymatyczna metoda oznaczania stężenia glukozy jest mikrometodą. Zlewki, cylindry, probówki, itd. należy przed myciem przepłukać wodą z kranu, następnie umyć wodą z dodatkiem niewielkiej ilości “Ludwika”, po czym płukać dużą ilością wody z kranu (15x) i 3x wodą destylowaną. I należy pamiętać, że wszystko ma też powierzchnię zewnętrzną. Ponieważ sprawozdanie opiera się na wynikach wszystkich grup ćwiczeniowych, nieuwaga 1 osoby może być przyczyną złych wyników grup następnych. Konsekwencje braku utrzymania odpowiedniej czystości szkła laboratoryjnego (co jest łatwe do sprawdzenia): kłopoty z wyznaczeniem stałych równania kinetycznego, brak zgodności ze stałą równowagi reakcji, problemy z oceną z ćwiczeń.

---