Dylewski Paweł
Gajowski Robert



Izomerazy to enzymy przekształcające
cząsteczkę w jej izomer, czyli zmieniające
układ atomów w cząsteczce



Nie dodają one, ani nie odcinają żadnych
atomów. Jedynie zmieniają ich układ w
cząsteczce



Przenoszone mogą być zarówno pojedyncze
atomy jak i ich całe grupy.



Ogólna reakcja: AB -> BA

Izomeraza glukozowa należy do klasy

izomeraz (EC 5), jest intramolekularną
oksydoreduktazą (EC 5.3) i konwertuje
aldozy i ketozy (EC 5.3.1), oraz jest piąta w
swojej klasie.

EC 5.3.1.5

Izomeryzowane substancje:



Glukoza do fruktozy



Fruktoza do glukozy



Ksyloza do ksylulozy

Ksyloza - węglowodan, monosacharyd

wchodzący w skład hemiceluloz w postaci

ksylanów.



D-ksylozo izomeraza



D-ksylozo ketoizomeraza



D-ksylozo ketol-izomeraza

Nazwa systematyczna: D-ksylozo aldozo-

ketozo-izomeraza

Mikroorganizmy:



Streptomyces sp. (np. actinoplanes)



Lactobacillus sp. (np. L. brevis)



Bacillus sp. (np. B. coagulans)



Paracolobactrum sp.



Clostridium sp. (np. C. thermosulfurogenes)

Źródło bakterii :

gorące źródła w
parku narodowym
Yellowstone

Enzym: termostabilna

izomeraza
glukozowa

Etapy:



Przygotowanie ekstraktu komórkowego



Ogrzewanie



Frakcjonowanie



Chromatografia kolumnowa

Całość przeprowadzamy w warunkach

tlenowych i 4

oC



50g komórek zawieszamy w 200ml 50 mM
buforu Mops

(3-morfolinopropanosulfonowy), 10mM

MgSO

4

, 1 mM CoCl

2



Dezintegracja prasą Francuską przy 124MPa



Odwirowanie przy 12000g, 20 min.



Zebranie supernatantu



Ogrzewanie supernatantu w termobloku, w
temperaturze 80

o

C



Ochłodzenie do 4

o

C



Odwirowanie przy 12000g przez 20 min



Dodanie stałego siarczanu amonu do
ogrzewanego ekstraktu w celu uzyskania
65% saturacji



Wytrącający się osad usunięto przez
odwirowanie 20000g przez 30 min.



Dodano kolejną porcję siarczanu, 85%
saturacja



Zebrano osad, zawieszono w buforze Mops i
dializowano przez noc w tym samym
buforze



Użyte złoże: DEAE-Sepharose CL-6B



Bufor Mops



Gradient chlorku sodu (0-0.5 M) do
przemywania

Następnie dokonano:



Ultrafiltracji



Filtracji żelowej



SDS-Page



Ogniskowanie izoelektryczne

Elektroforeza w żelu

denaturującym

pozwala na rozdział

cząstek pod

względem wielkości.

Uzyskanie

pojedynczego paska

świadczy o czystości

produktu.

Pozwala na rozdział

białek ze względu

na ich punkt

izoelektryczny.

Otrzymanie

pojedynczego paska

świadczy o

czystości produktu.



1ml mieszaniny reakcyjnej (0.8 M-glukoza,
10 mM-MgSO

4

, 1 mM-CoCI

2

i preparat

enzymatyczny w buforze 100 mM-Mops)
inkubowano w temp. 65

o

C przez 30 min.



Po tym czasie dodano 1ml 0.5M HClO

4

dla

zatrzymania reakcji



Do pomiaru glukozy wykożystano
amperometryczny czujnik enzymatyczny

Stałe te uzyskano z wykresu Lineweavera-

Burka

Jest to funkcja 1/rs=f(1/Cs), gdzie Cs to

stężenie substratu, a rs to zmiana tego
stężenia w czasie

Pomiarów dokonano w 65

o

C, dla 3 różnych

substratów

Na izomeryzację glukozy:
Do aktywności wymagane są jony Co

2+

albo

Mg

2+

Na izomeryzację ksylozy:
Do aktywności wymagane są jony Mn

2+

(1mM), Co

2+

(1 mM) albo Mg

2+

(1 mM)

Zarówno na izomeryzację glukozy jak i

ksylozy inhibicyjny wpływ mają jony Zn

2+

i

Cu

2+

Kropka to C.thermosulfurogenes
100% aktywności = 7.1 U/mg

Kropka to C.thermosulfurogenes
100% aktywności = 4.5 U/mg
użyto buforów: glicyloglicynowego(pH 3.0-4.5) i

Mops

(pH 6.5 – 8.6)

Kropka to C.thermosulfurogenes

Przemysł spożywczy – produkcja syropu

glukozowego zawierającego fruktoze

Wykożystanie: lody,ciasta, napoje, słodycze

Przemysł gorzelniczy:

Ksyluloza – źródło

węgla dla
fermentujących
drożdży

Proces SFIX -

Jednoczesna
Fermentacja i
Izomeryzacja Ksylozy.



Źródła internetowe



Internetowe bazy danych(NC-IUBMB,BRENDA)



Purification and characterization of
thermostable glucose isomerase from
Clostridium thermosulfurogenes and
Thermoanaerobacter strain B6A, Chanyong
LEE, J. Gregory ZEIKUS, Biochem. J. (1991)
273, 565-571



CHEMIA BIOORGANICZNA P. Kafarski B.
Lejczak