03.04.2014r.

Laboratorium Inżynieria bioreaktorów

Sprawozdanie

IZOMERYZACJA

Patrycja Janczak 193465

Judyta Raniś 193286

1.Wstęp teoretyczny:

W opisywanym doświadczeniu badaliśmy kinetykę szybkości reakcji enzymatycznej izomeryzacji D-glukozy do D-fruktozy. Jest to reakcja równowagowa, w której enzym wykazuje powinowactwo w stosunku do substratu, a także do produktu. Reakcja katalizowana jest przez enzym o nazwie izomeraza ksylozowa, która często potocznie (i jednocześnie błędnie) określana jest mianem izomerazy glukozowej. [1]

Stosowane w przemyśle izomerazy glukozowe są izolowane z takich bakterii jak na przykład: Bacillus circulans, które charakteryzują się dość wysoką odpornością na wysokie temperatury. W przemyśle enzymy te stosowane są do przekształcenia glukozy we fruktozę przy produkcji syropów fruktozowych. Dodatkowo enzym ten pozwala otrzymać wysoko fruktozowe syropy kukurydziane. Syropy fruktozowe są używane do słodzenia i są znacznie słodsze niż sacharoza, a jednocześnie mniej kaloryczne. Dodatkowo syropy kukurydziane eliminują problem krystalizacji. Mechanizm działania tego enzymu polega na otwarciu pierścienia substratów, następnie izomeryzacji poprzez wodorek oraz przejście od C-2, C-1, i zamknięcie pierścienia produktu. [2][4][5]

W badaniach kinetycznych szybkość tej reakcji w obecności różnych początkowych stężeń substratu mierzona jest zazwyczaj w bardzo wczesnym stadium reakcji, zanim stężenie produktu wzrośnie do znaczącego poziomu (stopień przereagowania substratu < 3%). Jeśli spełniony jest ten warunek, można wyznaczyć parametry kinetyczne reakcji zarówno w kierunku G->F, jak i F->G, stosując odpowiednie równania Michaelisa-Menten[1]:

$$K_{\text{eq}} = \frac{V_{max,F}*K_{m,\ F}}{V_{max,\ F}*K_{m,\ F}}$$

Bioreaktory ze złożem upakowanym zawierają cząstki stałe zbudowane z polimerów ściśliwych lub materiałów bardziej sztywnych. Złożem stałe jako biokatalizator może być porowate lub nieporowate i homogenne. Pożywka zawierająca substraty przepływa ciągle przez złoże upakowane biokatalizatora a w efekcie metabolity i produkty uwalniane są do cieczy i usuwane w strumieniu wypływającym. Przepływ może odbywać się z góry na dół lub z dołu do góry. Z reguły stosuje się przepływ z góry na dół na zasadzie grawitacji. Złoża upakowane z mniejszymi przestrzeniami powodują zmniejszenie przepływu cieczy, natomiast złoża z większą przestrzenią zapewniają większą prędkość przepływu. Jeżeli złoże zawiera cząstki ściśliwe to przepływ cieczy będzie utrudniony ze względu na zmniejszenie wolnej przestrzeni między nimi. Złoża upakowane stosowane są w bioreaktorach z im mobilizowanymi enzymami[3].

2. Cel ćwiczenia:

Zapoznanie się z procedurą postępowania przy wyznaczaniu stałych równania kinetycznego reakcji równowagowej.

3. Materiały oraz metody:

• Materiały:

- immobilizowana izomeraza glukozowa (poprawnie: izomeraza ksylozowa) otrzymano

nieodpłatnie z firmy Novozyme,

- objętość całkowita złoża – 20 cm³,

- objętość wolna reaktora – 6.8 cm³,

- temperatura procesu - 40 ^oC,

- roztwory glukozy i fruktozy,

- 0.05 M bufor tris-HCl + 3 mmol Mg, pH 7.8 w 40 ^oC,

- odczynniki do enzymatycznego oznaczania stężenia glukozy.

• Aparatura

- spektrofotometr UV-VIS Shimadzu,

- termostatowane reaktory kolumnowe,

- pompy tłokowe Prominent,

• Metody

Pomiar zmiany stężeń reagentów w warunkach początkowej szybkości reakcji.

Przygotowano po 500 cm³ dwóch roztworów fruktozy lub glukozy o podanych stężeniach. Substraty przelano wówczas do reaktora (chcąc uniknąć znacznych zanieczyszczeń próbek rozpoczęto od najmniejszego stężenia) i inkubowano w 40 ˚C przez dziesięć minut. W tym czasie przygotowano 24 próbówki dla pierwszego stężenia (20 próbówek dla glukozy jako substratu). Po inkubacji do reaktorów kolumnowych ze złożem upakowanych dozowano substrat z określonymi szybkościami przepływu (szybkości były sczytywane z karteczek przyklejonych do aparatów), rozpoczynając od najwyższych obrotów. Dla każdego przepływu zmierzono strumień (ściślej czas napełnienia cylindra do objętości 50 cm³), a następnie pobrano próbkę do analiz z wylotu reaktora, zmniejszono obroty i czynność powtórzono dla wszystkich ustawień pompy. Dla glukozy jako substratu dodatkowo pobierano próbkę na wejściu reaktora. Wszystkie próbki zawierające glukozę jako substrat zostały odpowiednio rozcieńczone (nie było to wymagane w przypadku fruktozy jako substratu), a następnie oznaczono stężenie glukozy testem enzymatycznym w 3 powtórzeniach (za pomocą odczynnika różowego).

Oznaczanie stężenia glukozy testem enzymatycznym.

Zasada metody. Glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej utlenia się do kwasu glukonowego z wytworzeniem nadtlenku wodoru, który w obecności peroksydazy powoduje zmianę zabarwienia chromogenu.

Oznaczanie stężenia glukozy. Do suchych i czystych probówek wprowadzono po 1 cm³ odczynnika różowego . W zależności od wykorzystywanego substratu ilość probówek wynosiła 16 dla fruktozy jako substratu (4 próbówki na pobranie próbek z wylotów x 3 powtórzenia + 3 probówki na standard + 1 probówka na kontrolę) oraz 19 probówek dla glukozy jako substratu (ze względu na dodatkowe oznaczenie poprawnego naważenia: 5 probówek na rozcieńczenia x 3 powtórzenia + 3 probówki na standard + 1 probówka na kontrolę). Z probówek zawierających odpowiednio rozcieńczone próbki badane oraz z próbki zawierającej standard, pobrano po 10 µl roztworu i dodano je do odczynnika różowego. Za każdym razem dokładnie wypłukano końcówkę w otrzymanym roztworze, a także w razie konieczności przed dodaniem 10 μl roztworu od odczynnika pozbywano się jego nadmiaru osadzonego na zewnętrznej stronie tipsa. Całość umieszczono na 5 min w łaźni wodnej o temperaturze 37 ^oC, a następnie zmierzono absorbancję (500 nm) wobec próby kontrolnej zawierającej jedynie odczynnik różowy.

Obliczanie stężenia glukozy. Wartość absorbancji dla standardu glukozy przyjęto jako 15 mmol/L. Z proporcji obliczono stężenie w próbkach badanych, uwzględniając rozcieńczenie.

Rozcieńczenia. W przypadku fruktozy, jako substratu, pobranych próbek nie rozcieńczono. Stosując jako substrat glukozę, wykonano rozcieńczenia:

Stężenie glukozy [mM]	Rozcieńczenie [-]	Objętość roztworu badanego [µl]	Objętość wody [ml]
50	2x	1000	1,0
100	3x	1000	2,0
200	10x	1000	9,0
400	20x	500	9,5
600	20x	500	9,5
800 1000 1250 1500 1750	40x 40x 50x 50x 100x	250 250 200 200 100	9,75 9,75 9,8 9,8 9,9

Wyznaczanie wartości Keq reakcji izomeryzacji.

Do 5 cm³ 0,05 M roztworu glukozy dodano 50 µl natywnej izomerazy glukozowej i umieszczono w łaźni wodnej o temperaturze 40 ^oC celem osiągnięcia stanu równowagi termodynamicznej. Pobrano próbki z wyjściowego roztworu substratu oraz z mieszaniny reakcyjnej, rozcieńczono je wodą destylowaną (wartości podano w tabeli powyżej) oraz oznaczono stężenie glukozy metodą enzymatyczną[1].

4.Wyniki oraz obliczenia dla reakcji izomeryzacji D-glukozy do D-fruktozy:

Oznaczenia:

• Abs_st.sr.  - absorbancja średnia standardu,

• Abs_sr.sub. - absorbancja średnia substratu,

• R - rozcieńczenie,

• x - początkowe stężenie glukozy nie uwzględniające rozcieńczenia,

• Cs_rz, 0 - rzeczywiste stężenie początkowe glukozy,

• Abs_sr. - absorbancja średnia próbki,

• x - stężenie glukozy w próbce nie uwzględniające rozcieńczenia.,

• C_g - stężenie glukozy w próbce,

• C_p - stężenie produktu,

• $\dot{V}$ - objętościowe natężenie przepływu,

• t - czas,

• τ - czas przebywania w reaktorze,

• V_R - objętość robocza reaktora,

• α - obliczenie stopnia przereagowania,

• r - szybkość reakcji,

• C_p - stężenie produktu.

Miejsca oznaczone "-" są jednoznaczne z odrzuceniem wyników ze względu na ich dużą rozbieżność z pozostałymi pomiarami

Dla 50 mM glukozy:

Cs,rz,0	RP	R	t	Cg	Cp	$\dot{\mathbf{V}}$	τ	α	r
[mM]	[-]	[-]	[s]	[mM]	[mM]	[mL/s]	[s]	[%]	[mM/s]
50,568	30	2	34	50,024	0,544	1,471	4,42	1,08	0,123
	20	2	55	50,459	0,109	0,909	7,15	0,21	0,015
	10	2	87	49,661	0,907	0,575	11,31	1,79	0,080
	0	2	212	49,117	1,451	0,236	27,56	2,87	0,053

standard	substrat
Abs st.1	0,832
Abs st.2	0,778
Abs st.3	0,872
Abs st. Śr	0,827

Próbki z reaktora
RP
30
20
10
0

Obliczenia dla 50 mM glukozy:

Obliczenie rzeczywistego stężenia początkowego glukozy:

Abs_st.sr.       −      15mM

Abs_sr.sub.      −        x

$$x = \frac{15 \bullet \text{Abs}_{sr.sub.}}{\text{Abs}_{st.\ sr.\ }\ } = \frac{15 \bullet 1,394}{0,827} = 25,284$$

R = 2

Cs_rz, 0 = x * 2 = 25, 284 * 2 = 50, 568 [mM]

Obliczenie stężenia glukozy w próbce:

Abs_st.sr.       −      15mM

Abs_sr.      −        x

$$x = \frac{15 \bullet \text{Abs}_{sr.}}{\text{Abs}_{st.\ sr.\ }\ } = \frac{15 \bullet 1,379}{0,827} = 25,012\ $$

R = 2

C_g = x * 2 = 25, 284 * 2 = 50, 024 [mM]

Pozostałe obliczenia stężenia glukozy wykonano analogicznie, przyjmując jedynie odpowiednie wartości Abs_sr.

Obliczenie stężenia otrzymanego produktu (fruktozy):

C_p = Cs_rz, 0 −  C_g = 50, 568 −  50, 024 = 0, 544 [mM] 

Pozostałe obliczenia stężenia produktu dokonano analogicznie, posługując się odpowiednimi wartościami stężenia glukozy (C_g).

Obliczenie objętościowego natężenia przepływu:

$$\dot{V} = \frac{50}{t} = \frac{50}{34} = 1,471\ \lbrack\frac{\text{mL}}{s}\rbrack$$

Pozostałe obliczenia wykonano analogicznie, uwzględniają odpowiednie wartości czasu (t).

Obliczenie czasu przebywania w reaktorze:

$$\tau = \frac{V_{R}}{\dot{V}} = \frac{6,5}{1,471} = 4,42\ \left\lbrack s \right\rbrack$$

Pozostałe obliczenia wykonano analogicznie, uwzględniają odpowiednie wartości
objętościowego natężenia przepływu $\dot{(V})$.

Obliczenie stopnia przereagowania:

$$\alpha = \frac{C_{p}}{C_{s,rz,0}} \bullet 100\% = \frac{0,544}{50,568} \bullet 100 = 1,08\ \lbrack\%\rbrack$$

Uwaga! Badanie kinetycznych szybkości reakcji przeprowadza się na początku doświadczenia, w związku z czym stopień przereagowania powinien osiągać wartość mniejszą od 3 %.

Pozostałe obliczenia wykonano analogicznie, uwzględniają odpowiednie wartości
stężenia produktu (C_p ).

Obliczenie szybkości reakcji:

$$r = \frac{C_{p}}{\tau} = \frac{0,544}{4,42} = 0,123\ \lbrack\frac{\text{mM}}{s}\rbrack$$

Pozostałe obliczenia wykonano analogicznie, uwzględniają odpowiednie wartości
stężenia produktu (C_p ) oraz czasu przebywania (τ).

Wszystkie pozostałe obliczenia wykonano analogicznie jak dla 50 mM glukozy.

Dla glukozy 200 mM:

Cs,rz,0	RP	R	t	Cg	Cp	$\dot{\mathbf{V}}$	τ	α	r
[mM]	[-]	[-]	[s]	[mM]	[mM]	[mL/s]	[s]	[%]	[mM/s]
242,703	80	10	66	235,291	7,413	0,758	8,58	3,05	0,864
	60	10	96	234,767	7,936	0,521	12,48	3,27	0,636
	40	10	127	235,029	7,674	0,394	16,51	3,16	0,465
	20	10	405	136,919	105,785	0,123	52,65	43,59	2,009

standard	substrat
Abs st.1	0,806
Abs st.2	0,592
Abs st.3	1,182
Abs st. Śr	0,860

Próbki z reaktora
RP
80
60
40
20

Dla glukozy 400 mM:

Cs,rz,0	RP	R	t	Cg	Cp	$\dot{\mathbf{V}}$	τ	α	r
[mM]	[-]	[-]	[s]	[mM]	[mM]	[mL/s]	[s]	[%]	[mM/s]
360	80	20	58	355,887	4,113	0,862	7,54	1,14	0,545

standard	substrat
Abs st.1	-
Abs st.2	-
Abs st.3	0,620
Abs st. Śr	0,620

Próbki z reaktora
RP
80

Pozostałą część obliczeń pominięto ze względu na dużą rozbieżność absorbancji otrzymanej na podstawie badania próbek z reaktora.

Dla glukozy 800 mM:

Cs,rz,0	RP	R	t	Cg	Cp	$\dot{\mathbf{V}}$	τ	α	r
[mM]	[-]	[-]	[s]	[mM]	[mM]	[mL/s]	[s]	[%]	[mM/s]
832,034	80	40	30	819,310	12,724	1,667	3,9	1,53	3,263
	60	40	56	811,862	20,172	0,893	7,28	2,42	2,771
	40	40	91	813,517	18,517	0,549	11,83	2,23	1,565
	20	40	199	813,517	18,517	0,251	25,87	2,23	0,716

standard	substrat
Abs st.1	0,911
Abs st.2	0,994
Abs st.3	0,995
Abs st. Śr	0,967

Próbki z reaktora
RP
30
20
10
0

Dla glukozy 1750 mM:

Cs,rz,0	RP	R	t	Cg	Cp	$\dot{\mathbf{V}}$	τ	α	r
[mM]	[-]	[-]	[s]	[mM]	[mM]	[mL/s]	[s]	[%]	[mM/s]
1417,368	20	100	213	1489,474	-72,105	0,235	27,69	-5,09	-2,604

standard	substrat
Abs st.1	0,930
Abs st.2	0,980
Abs st.3	0,940
Abs st. Śr	0,950

Próbki z reaktora
RP
0

Pozostałą część obliczeń pominięto ze względu na dużą rozbieżność absorbancji otrzymanej na podstawie badania próbek z reaktora. Otrzymane wyniki, przyjmują wartości ujemne, co pozwala nam sądzić, że są niepoprawne. W związku z tym obliczenia dla glukozy 1750 mM nie zostały użyte w dalszym toku opracowywania otrzymanych wyników.

Na czerwono zaznaczono stopnie przereagowania, które przekroczyły wartość 3%. Należy zwrócić uwagę na fakt, że zazwyczaj pozostałe parametry również wskazują na popełnienie sporego błędu.

Po naniesieniu wszystkich danych początkowego stężenia rzeczywistego glukozy i odpowiadającym im wartości szybkości reakcji na wykres zależności Cs,rz,0=f(r), wybrano punkty, których położenie wyznaczało kształt najbardziej zbliżony do krzywej Michaelisa-Menten. Zwrócono uwagę, na punkty, które w charakterystyczny dla tej krzywej sposób stopniowo ją wypłaszczały.

Następnie sprawdzono stopienie przereagowania i wykreślono punkty, dla których jego wartość przekraczała 3%. W efekcie, z dużej ilości pomiarów na wykresie zachowały się tylko 3 punkty, które w naszym mniemaniu bardzo przypominają kształt krzywej Michaelisa-Menten. Ze względu na duże uproszczenia (wynikające z obecności zaledwie 3 punktów) przy zastosowaniu odpowiedniej linii trendu, zrezygnowano z niej.

Dane użyte do sporządzenia wykresu:

Cs,rz,0	r	1/Cs,rz,0	1/r
[mM]	[mM/s]	[1/mM]	[s/mM]
50,568	0,08	0,0198	12,500
360	0,545	0,0028	1,834
832,034	0,716	0,0012	1,396

Równanie odczytane z wykresu: y=610,02x+0,4135=ax+b

$$\frac{1}{r} = \frac{K_{M}}{V_{\max}} \bullet \frac{1}{C_{s,rz,0}} + \frac{1}{V_{\max}}$$

$$\frac{1}{V_{\max}} = b = 0,4135$$

$${V_{\max}}_{G} = \frac{1}{0,4135} = 2,42\ \lbrack\frac{\text{mM}}{s}\rbrack$$

$$\frac{K_{M}}{V_{\max}} = a = 610,02$$

K_MG = 610, 02 * 2, 42 = 1476, 2484 [mM]

5. Wyniki oraz obliczenia dla reakcji izomeryzacji D-fruktozy do D- glukozy:

Oznaczenia:

• C_p – stężenie produktu - glukozy,

• C_s – stężenie substratu - fruktozy,

• A_{śr g} – średnia absorbancja glukozy,

• A_{śr s} – średnia absorbancja standardu,

• C_stand - stężenie standardu,

• α – stopień przereagowania,

• Ṽ - strumień przepływu,

• V_pob. – pobrana objętość z reaktora,

• t – czas pobierania próbki,

• Vr – objętość reaktora,

• Ʈ – czas przebywania w reaktorze,

• r – szybkość reakcji,

• K_m- stała Michaelisa-Menten,

• V_{max, F}- maksymalna szybkość reakcji dla fruktozy.

• Dane:

C_stand – 15 [mM]

Vr – 6,5 [ml]

M_f – 180,16 [g/mol]

Miejsca oznaczone "-" są jednoznaczne z odrzuceniem wyników ze względu na ich dużą rozbieżność z pozostałymi pomiarami.

Obliczenia dla fruktozy 800 mM:

m = Cs * V * M = 800 * 10⁻³ * 500 * 10⁻³ * 180, 16 = 72, 064 [g]

1M − 0, 05M  [20x]

$$R = \frac{4l}{x}\ \ \rightarrow \ \ \ X = \frac{4}{20} = 0,2l$$

200 ml buforu + 3800 ml wody

Obliczenie stężenia otrzymanego produktu :

$$C_{p} = C_{g} = \frac{A_{sr,g}*C_{\text{stand.}}}{A_{sr,stand.}} = \frac{0,188*15}{0,889} = 3,172\ \left\lbrack \text{mM} \right\rbrack$$

Pozostałe obliczenia stężenia produktu dokonano analogicznie, posługując się odpowiednimi wartościami absorbancji.

Obliczenie stopnia przereagowania:

$$\alpha = \frac{C_{p}*100\%}{C_{s}} = \frac{3,172*100\%}{800} = 0,397\ \%$$

Uwaga! Badanie kinetycznych szybkości reakcji przeprowadza się na początku doświadczenia, w związku z czym stopień przereagowania powinien osiągać wartość mniejszą od 3 %.

Pozostałe obliczenia wykonano analogicznie, uwzględniając odpowiednie wartości
stężenia produktu (C_p ). W tabeli wyników na czerwono zaznaczono wyniki, które przekroczyły próg stopnia przereagowania.

Obliczenie objętościowego natężenia przepływu:

$$\dot{V} = \frac{V_{\text{pob.}}}{t} = \ \frac{50}{67,44} = 0,741\ \left\lbrack \frac{\text{ml}}{s} \right\rbrack$$

Pozostałe obliczenia wykonano analogicznie, uwzględniają odpowiednie wartości czasu (t).

Obliczenie czasu przebywania w reaktorze:

$$\tau = \frac{V_{R}}{\dot{V}} = \frac{6,5}{0,741} = 8,767\ \left\lbrack s \right\rbrack$$

Pozostałe obliczenia wykonano analogicznie, uwzględniają odpowiednie wartości
objętościowego natężenia przepływu $\dot{(V})$.

Obliczenie szybkości reakcji:

$$r = \frac{C_{p}}{\tau} = \frac{3,172}{8,767} = 0,362\ \lbrack\frac{\text{mM}}{s}\rbrack$$

Pozostałe obliczenia wykonano analogicznie, uwzględniają odpowiednie wartości
stężenia produktu (C_p ) oraz czasu przebywania (τ).

Wszystkie pozostałe obliczenia dla fruktozy wykonano analogicznie.

• W celu ujednolicenia krzywej, niektóre pomiary zostały pominięte:

• Parametry kinetyczne odczytane z wykresu Lineweaver- Burk’a:

y = 715, 5x + 0, 4446

$$\frac{1}{r} = \frac{K_{m}}{V_{\max}}*\frac{1}{C_{s}} + \frac{1}{V_{\max}}$$

$$K_{m,\ F} = \frac{715,5}{0,4446} = \ \ 1213,808\lbrack mM\rbrack$$

$$V_{max,F} = \frac{1}{0,4446} = \ \ 2,236\ \lbrack\frac{\text{mM}}{s}\rbrack$$

6. Wyniki oraz obliczenia stałej równowagi K_eq reakcji immobilizacji:

Oznaczenia:

• A_f – absorbancja fruktozy w stanie równowagi,

• A_g – absorbancja glukozy w stanie równowagi,

• A_0,g- absorbancja dla wyjściowego stężenia glukozy,

• Ɛ – współczynnik ekstynkcji,

• l – długość drogi optycznej,

• C_f – stężenie fruktozy w stanie równowagi,

• C_g – stężenie glukozy w stanie równowagi,

• V_{max, G} - szybkość maksymalna dla glukozy,

• V_{max, F} - szybkość maksymalna dla fruktozy,

• K_{m, G} - stała Michaelisa-Menten dla glukozy,

• K_{m, F} - stała Michaelisa-Menten dla fruktozy.

Przykładowe obliczenia dla wartości absorbancji A_{0,g śr}=1,343;

A_f = A_0, g sr − A_g sr = 1, 343 − 0, 644 = 0, 699

$$A = C*l*E\ \ \ \ \ - \rightarrow \ \ \ \ \ \ C = \frac{A}{l*E}$$

Obliczenie stałej równowagi z wyników otrzymanych w trakcie doświadczenia:

$$K_{eq,\ exper.} = \frac{C_{f}}{C_{g}} = \frac{A_{f}*E*l}{A_{g}*E*l} = \frac{A_{f}}{A_{g,\ sr}} = \frac{0,699}{0,644} = 1,086$$

Obliczenie stałej równowagi ze wzoru Haldana:

$$K_{eq,\ obl.} = \frac{V_{\text{ma}x,\ G}*K_{m,\ F}}{V_{max,\ F}*K_{m,\ G}} = \ \frac{2,42*\ 1213,808}{2,236*1476,2484} = 0,848$$

• Wyniki:

A0, g [G]	A0, g śr	Ag [G+E]	Ag, śr	Af	Keq, exper.	Keq, śr esper.
1,316	1,343	0,613	0,644	0,699	1,086	0,785
1,363		0,654
1,35		0,664
1,522	1,55	1,005	0,878	0,672	0,765
1,567		0,836
1,561		0,793
1,399	1,459	0,84	0,794	0,666	0,839
1,495		0,781
1,484		0,76
1,262	1,266	0,838	0,723	0,544	0,752
1,282		0,656
1,255		0,674

Keq, exper.	Keq, obl.
0,785	0,848

7.Wnioski:

Celem wykonanego ćwiczenia było zapoznanie się z procedurą postępowania, która miała na celu wyznaczenie stałych równania kinetycznego dla reakcji równowagowej, jaką jest reakcja przeprowadzana przez enzym izomerazę ksylozową. Niewątpliwie cel ćwiczenia udało się zrealizować. Każda z osób biorąca aktywnie udział w ćwiczeniach laboratoryjnych zapoznała się bowiem z tokiem przeprowadzania tego doświadczenia.

Na podstawie wykonanego doświadczenia otrzymano następujące wyniki stałej równowagowej K_eq: dla opracowanych wyników otrzymano wartość 0,848, natomiast dla wzoru Haldana 0,785. Porównanie obu wyników dostarcza nam informacji na temat poprawności wykonanych pomiarów oraz obliczeń na ich podstawie[1]. Otrzymane wyniki nie różnią się drastycznie od siebie, uznano je więc za zadowalające, jednakże nie są to wyniki idealne - różnica pomiędzy otrzymanymi wartościami wynosi 0,063, co stanowi niemal 8 % błędu w stosunku do uśrednionej wartości K_eq. Błąd tego rzędu, zwłaszcza dla wartości uśrednionej nie jest błędem pomijalnym. Udało nam się jednak uzyskać porównywalne wyniki stałych Michaelisa-Menten dla glukozy oraz fruktozy, a także prędkości maksymalnych dla obu substratów. Potwierdza to więc fakt, że izomeryzacja D-glukozy jest procesem równowagowym.

Ponieważ pomiary, mające na celu późniejsze wyznaczenie stałych równania kinetycznego, dokonuje się w początkowych stężeniach substratu, w trosce o poprawność końcowych wyników, pominięto wszystkie wyniki dla których otrzymano stopień przereagowania większy lub równy 3,00 %. Niestety w praktyce okazało się, że na etapie tej selekcji odpada wiele wyników, w tym nie uzyskano żadnej pożądanej wartości stopnia przereagowania dla 200 mM roztworu glukozy.

Do problemów z otrzymaniem wymaganej wartości stopnia przereagowania dodajmy duże rozproszenie pozostałych punktów , które spełniły kryteria stopnia przereagowania, a których obecność została rozważona przy sporządzaniu krzywej Michealisa - Menten. Na tym etapie również odpadło wiele punktów, które w naszym mniemaniu, zupełnie nie pasowały do kształtu zależności M-M. Początkowo stworzyłyśmy 3 ciągi punktów, które mogłyby obrazować tą zależność, jednak po wspólnych przemyśleniach wytypowałyśmy jedną, naszym zdaniem najpoprawniejszą z nich. W efekcie dla wykresu zależności M-M dla glukozy jako substratu zachowano zaledwie 3 punkty, co niewątpliwie wpłynęło na poprawność otrzymanych wyników. Nieco lepiej wypada zależność sporządzona dla fruktozy jako substratu, ale nadal koniecznym było pozbycie się kilku punktów.

Powodem zaistniałych problemów mogło być niedokładne wykonanie doświadczenia. Już w instrukcji do tego ćwiczenia laboratoryjnego jest dokładnie zaznaczone, iż zastosowana przez nas metoda jest mikrometodą, w związku z czym należało bardzo dokładnie pipetować odpowiednie objętości roztworów, a także dbać o czystość używanego szkła laboratoryjnego[1]. Jednocześnie możliwość popełnienia znacznego błędu z powodu niedokładności wykonania doświadczenia, została ograniczona, ponieważ ze wszystkich grup wykonujących to doświadczenie prowadzący wytypowali kilka najlepszych wyników. To z kolei, biorąc także pod uwagę ilość odrzuconych punktów, pozwala sądzić, że sama metoda nie należy do metod nazbyt dokładnych.

8. Przypis:

[1]- Instrukcja „Izomeryzacja” laboratorium „Inżynierii bioreaktorów”, PWr, Wrocław

[2]- [online] Artykuł „Enzymy”, dostępny w Internecie: http://pl.wikipedia.org/wiki/Wikiprojekt:T%C5%82umaczenie_artyku%C5%82%C3%B3w/Enzymy

[3]- [online] Artykuł „Rodzaje bioreaktorów i ich wykorzystanie w biotechnologii”, dostępny w Internecie http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Rodzaje-bioreaktorow-i-ich-wykorzystanie-w-biotechnologii/

[4]- [online] Molecular and industrial aspects of glucose isomerase, dostępny w Internecie http://mmbr.asm.org/content/60/2/280.full.pdf