LABORATORIUM Z BIOCHEMII.

Ćwiczenie nr.5

„Ochrona Środowiska”

Grupa dziekańska nr. II

Czwartek godz.: 16:15-20:00

Grupa:

Maciej Kurzyk

Magdalena Kołuda

Jacek Bogdański

Temat: Kinetyka reakcji enzymatycznych.

(Wpływ pH, temperatury, aktywatorów i inhibitorów na szybkość reakcji enzymatycznych.)

Uwagi: ______________

Ocena: ______________

Wstęp - teoria.

• Szybkość katalizowanej przez enzym przemiany danego substratu w produkt zależy od:

-stężenia enzymu i substratu

-stężenia jonów wodorowych

-temperatury reakcji

-potencjału redukcyjno-oksydacyjnego środowiska

-obecności koenzymów, aktywatorów i inhibitorów

-siły jonowej

-stałej dielektrycznej środowiska

• Wpływ pH na aktywność enzymów:

-enzymy jako białka mogą występować w formie:

• elektrododatniego kationu

• elektroobojętnego amfijonu

• elektroujemnego anionu

-pH wpływa na czynność katalityczną enzymu, terminuje siłę oddziaływań wodorowych i jonowych, które stabilizują konformację molekuły oraz, które umożliwiają powstanie kompleksu enzym-substrat

-zależność V= f(pH) - w miarę oddalania się od wartości pH optymalnego, aktywność enzymu obniża się

• Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznych

-wzrost temperatury wywołuje wzrost szybkości reakcji chemicznej zgodnie z równaniem Arrheniusa:

V= k[S] k =A e

-wzrost temperatury zwiększa kinetyczną energię substancji regulujących, a więc prawdopodobieństwo ich skutecznych zderzeń

-podwyższona temperatura osłabia, a po przekroczeniu pewnej wartości nawet niszczy niektóre słabe oddziaływania w molekule enzymu, co prowadzi do stopniowej denaturacji białka enzymatycznego

-optymalna temperatura działania enzymu jest zależna od czasu w jakim zachodzi reakcja enzymatyczna

-im czas reakcji krótszy, tym mniej rozległy zasięg zmian denaturacyjnych w białku enzymatycznym poddanym działaniu danej temperatury

Dla większości enzymów, zmiany denaturacyjne zachodzą bardzo intensywnie powyżej 40-50'C, ale są i takie, które wykazują znaczną odporność na inaktywujące działanie podwyższonej temperatury. Cechuje je wysoka termostabilność.

Termostabilność jest zależna od:

-pH,

-siły jonowej, -środowiska

-obecności w nim różnych substancji niskocząsteczkowych

• Aktywatory i inhibitory enzymów:

1. Aktywatory - przyspieszają katalityczne działanie enzymu.

Do aktywatorów zaliczamy:

-jony niektórych metali - zwłaszcza dwuwartościowych (Mg2+, Zn2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+)

Jon metalu może brać bezpośredni udział w reakcji lub stabilizować jej aktywną

konformację.

-substancje białkowe - odmaskowują grupy czynne enzymów

-niskocząsteczkowe związki organiczne - znoszą działanie inhibitorów enzymów

2. Inhibitory - opóźniają katalityczne działanie enzymu. Mogą mieć charakter specyficzny lub niespecyficzny.

Inhibitory specyficzne - obniżają aktywność ściśle określonych enzymów. Wyróżniamy:

-inhibitory kompetycyjne (współzawodniczące) - które współpracują z enzymem w tym samym obszarze cząsteczki co substrat. Są strukturalnie podobne do substratu, łączą się z enzymem odwracalnie.

-inhibitory niekompetycyjne - które wiążą się z enzymem w innym obszarze cząsteczki, nie substratu ( w centrum allosterycznym). Mogą się łączyć z wolnym enzymem, lub z kompleksami enzymu-substrat.

Inhibitory niespecyficzne - wiążą się łatwo i w sposób nieodwracalny ze wszystkimi białkami, powodując rozległe zmiany ich konformacji, prowadząc do denaturacji, której często towarzyszy wypadanie białka w postaci osadu. Są to jony metali ciężkich (Cu, Pb, Hg, As, Ag). Jon metalu ciężkiego może połączyć się w centrum katalitycznym oraz w innym obszarze cząsteczki.

Wykonanie ćwiczenia. Wnioski.

I. Wpływ pH na aktywność α-amylazy

Do roztworów buforowych o różnych pH dodajemy roztworu skrobi. Następnie w równych odstępach czasu dodajemy α-amylazy. Zawartość probówek natychmiast mieszamy. Co 0,5 minuty przenosimy próby każdego z hydrolizatów na płytki z roztworem jodu w KJ. Powstające na płytkach zabarwienie wskazuje stopień rozkładu skrobi w danej próbie. Gdy jedna z nich w reakcji z jodem zabarwi się na jasnobrunatny kolor, należy w równych odstępach czasu dodać do wszystkich hydrolizatów 3 krople roztworu jodu w KJ. Natychmiast wymieszać zawartość probówek i obserwować powstałe zabarwienie.

Obserwacje:

pH	Zabarwienie hydrolizatu w reakcji z jodem w KJ	Stopień hydrolizy skrobi (rodzaj produktu)
3	Granatowe	Skrobia nierozłożona
4	Fioletowe	Amylodekstryny i erytrodekstryny
5	Jasno-brązowe	Amylodekstryny i Erytrodekstryny (przewaga)
6	Średnio-brązowe	Erytrodekstryny
7	Fioletowe	Amylodekstryny i erytrodekstryny
8	Ciemno-granatowe	Skrobia nierozłożona

Wnioski:

- Kolor granatowy świadczy o tym iż skrobia nie została rozłożona co widać po probówkach z

zawartością pH=3 i pH=8.

- Probówki o pH= 4, pH=6 i pH=7 których kolory były ciemniejsze ukazują nam częściowe

rozłożenie skrobi.

- W probówce z zawartością pH=5 gdzie barwa miała najjaśniejszy odcień brązu świadczy o

tym iż hydroliza wpłynęła na nią najbardziej.

α-amylaza rozkłada tylko wewnętrzne wiązania α-1,4-glikozydowe, powodując stopniowe rozszczepianie łańcuchów na coraz krótsze fragmenty zwane dekstrynami. Przebieg tego etapu degradacji skrobi zwanego etapem dekstrynowania można śledzić dzięki barwnej reakcji z roztworem jodu w KJ, nierozłożonej skrobi i dłuższych dekstryn.

II. Wpływ temperatury.

Do koloidalnego roztworu skrobi dodajemy buforu o pH optymalnym dla działania badanego preparatu α-amylazy. Inkubujemy w ciągu 5 minut w różnych temperaturach. Po tym czasie dodajemy roztworu α-amylazy. Natychmiast mieszamy i ponownie inkubujemy w danych temperaturach w ciągu 3 minut. Następnie do probówki z DNS wprowadzamy mieszanine reakcyjną. Mieszamy i umieszczamy na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej, po czym schładzamy i dodajemy wody destylowanej. Mieszamy ponownie i mierzymy absorbancję roztworu wobec próby odczynnikowej zawierającej wodę destylowaną. Z krzywej wzorcowej odczytujemy stężenia cukrów redukujących w mieszaninie reakcyjnej w przeliczeniu na maltozę.

Obliczenia:

Temperatura Hydrolizy °C	pokojowa	40	50	60	70	80
Stężenie cukrów redukujących mg maltozy/cm³	0,350	0,800	1,680	1,255	0,490	0,400

Wykres:

Wnioski:

Wraz ze wzrostem temperatury, stężenie cukrów redukujących w wykonanym ćwiczeniu wzrastało i stopniowo osiągnęło maksimum przy 50°C, po czym zaczęło spadać. W miarę oddalania się od wartości pH optymalnego (50°C), aktywność enzymu obniża się. Podwyższona temperatura osłabia, a po przekroczeniu pewnej wartości nawet niszczy niektóre słabe oddziaływania w molekule enzymu, co prowadzi do stopniowej denaturacji białka enzymatycznego.

III. Badanie termostabilności α-amylazy.

Do roztworu α-amylazy dodajemy buforu o pH optymalnym i inkubujemy w ciągu 10 minut w różnych temperaturach. Po 10 minutach roztwór enzymu schładzamy do temperatury pokojowej dodajemy roztworu skrobi po czym dokładnie mieszamy. Inkubujemy w ciągu 3 minut w temperaturze pokojowej po czym pobieramy mieszaninę reakcyjną i wprowadzamy do roztworu DNS. Mieszamy i umieszczamy na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej. Schładzamy, dodajemy wody destylowanej i ponownie dokładnie mieszamy. Mierzymy ekstrakcję roztworu wobec próby odczynnikowej zawierającej wodę destylowaną. Z krzywej wzorcowej odczytujemy stężenie cukrów redukujących w mieszaninie reakcyjnej.

Obliczenia:

Temperatura preinkubacji [°C]	Pokojowa	40	50	60	70	80
Stężenie cukrów redukujących	0,65	0,62	0,39	0,195	0,17	0,12

Wykres:

Wnioski:

Termostabilność jest to najwyższa temperatura przy której nie dochodzi do termicznej inaktywacji enzymu poddawanego działaniu tej temperatury w nieobecności substratu.

Termostabilność jest zależna od pH, siły jonowej, środowiska oraz obecności w nim różnych substancji niskocząsteczkowych.

10 minutowa preinkubacja nie spowodowała spadku aktywności α-amylazy w temperaturze 20°C (temperaturze pokojowej) do 40°. Powyżej tych temperatur zaczęła postępować denaturacja α-amylazy.

IV. Wpływ aktywatorów i inhibitorów na α-amylazę.

Do roztworu skrobi dodajemy:

Probówka 1 => wody destylowanej (+ α-amylazy śliny)

Probówka 2 => roztworu NaCl (+ α-amylazy śliny)

Probówka 3 => CuSO4 (+ α-amylazy śliny)

Następnie do wszystkich dodajemy roztworu α-amylazy śliny. Pobieramy z każdej probówki po kropli hydrolizatu. I przeprowadzamy reakcję z roztworem jodu w KJ. W chwili gdy próba jednego z hydrolizatów będzie dawała z jodem reakcję ujemną, dodajemy do wszystkich probówek 4 krople roztworu jodu w KJ i natychmiast mieszamy zawartość probówek.

Obserwaje:

Probówka 1	Wystąpiło odbarwienie na kolor fioletowo-niebieski.
Probówka 2	Wystąpiło odbarwienie na kolor jasno niebieski.
Probówka 3	Wystąpiło odbarwienie na kolor ciemno granatowy.

Wnioski:

Aktywatorami są jony Cl przyspieszając katalityczne działanie enzymu (aktywując α-amylazę śliny). Za inhibitory które opóźniają i obniżają aktywność enzymu posłużyły nam woda destylowana i CuSO4.

Bibliografia:

1. Instrukcja do ćwiczenia

2. http://portalwiedzy.onet.pl/

3. Notatki

---