-wzrost temperatury wywołuje wzrost szybkości reakcji chemicznej zgodnie z równaniem Arrheniusa:
LABORATORIUM Z BIOCHEMII.
Ćwiczenie nr.5
„Ochrona Środowiska”
Grupa dziekańska nr. II
Czwartek godz.: 16:15-20:00
Grupa:
Maciej Kurzyk
Magdalena Kołuda
Jacek Bogdański
Temat: Kinetyka reakcji enzymatycznych.
(Wpływ pH, temperatury, aktywatorów i inhibitorów na szybkość reakcji enzymatycznych.)
Uwagi: ______________
Ocena: ______________
Wstęp - teoria.
Szybkość katalizowanej przez enzym przemiany danego substratu w produkt zależy od:
-stężenia enzymu i substratu
-stężenia jonów wodorowych
-temperatury reakcji
-potencjału redukcyjno-oksydacyjnego środowiska
-obecności koenzymów, aktywatorów i inhibitorów
-siły jonowej
-stałej dielektrycznej środowiska
Wpływ pH na aktywność enzymów:
-enzymy jako białka mogą występować w formie:
elektrododatniego kationu
elektroobojętnego amfijonu
elektroujemnego anionu
-pH wpływa na czynność katalityczną enzymu, terminuje siłę oddziaływań wodorowych i jonowych, które stabilizują konformację molekuły oraz, które umożliwiają powstanie kompleksu enzym-substrat
-zależność V= f(pH) - w miarę oddalania się od wartości pH optymalnego, aktywność enzymu obniża się
Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznych
-wzrost temperatury wywołuje wzrost szybkości reakcji chemicznej zgodnie z równaniem Arrheniusa:
V= k[S] k =A e
-wzrost temperatury zwiększa kinetyczną energię substancji regulujących, a więc prawdopodobieństwo ich skutecznych zderzeń
-podwyższona temperatura osłabia, a po przekroczeniu pewnej wartości nawet niszczy niektóre słabe oddziaływania w molekule enzymu, co prowadzi do stopniowej denaturacji białka enzymatycznego
-optymalna temperatura działania enzymu jest zależna od czasu w jakim zachodzi reakcja enzymatyczna
-im czas reakcji krótszy, tym mniej rozległy zasięg zmian denaturacyjnych w białku enzymatycznym poddanym działaniu danej temperatury
Dla większości enzymów, zmiany denaturacyjne zachodzą bardzo intensywnie powyżej 40-50'C, ale są i takie, które wykazują znaczną odporność na inaktywujące działanie podwyższonej temperatury. Cechuje je wysoka termostabilność.
Termostabilność jest zależna od:
-pH,
-siły jonowej, -środowiska
-obecności w nim różnych substancji niskocząsteczkowych
Aktywatory i inhibitory enzymów:
1. Aktywatory - przyspieszają katalityczne działanie enzymu.
Do aktywatorów zaliczamy:
-jony niektórych metali - zwłaszcza dwuwartościowych (Mg2+, Zn2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+)
Jon metalu może brać bezpośredni udział w reakcji lub stabilizować jej aktywną
konformację.
-substancje białkowe - odmaskowują grupy czynne enzymów
-niskocząsteczkowe związki organiczne - znoszą działanie inhibitorów enzymów
2. Inhibitory - opóźniają katalityczne działanie enzymu. Mogą mieć charakter specyficzny lub niespecyficzny.
Inhibitory specyficzne - obniżają aktywność ściśle określonych enzymów. Wyróżniamy:
-inhibitory kompetycyjne (współzawodniczące) - które współpracują z enzymem w tym samym obszarze cząsteczki co substrat. Są strukturalnie podobne do substratu, łączą się z enzymem odwracalnie.
-inhibitory niekompetycyjne - które wiążą się z enzymem w innym obszarze cząsteczki, nie substratu ( w centrum allosterycznym). Mogą się łączyć z wolnym enzymem, lub z kompleksami enzymu-substrat.
Inhibitory niespecyficzne - wiążą się łatwo i w sposób nieodwracalny ze wszystkimi białkami, powodując rozległe zmiany ich konformacji, prowadząc do denaturacji, której często towarzyszy wypadanie białka w postaci osadu. Są to jony metali ciężkich (Cu, Pb, Hg, As, Ag). Jon metalu ciężkiego może połączyć się w centrum katalitycznym oraz w innym obszarze cząsteczki.
Wykonanie ćwiczenia. Wnioski.
I. Wpływ pH na aktywność α-amylazy
Do roztworów buforowych o różnych pH dodajemy roztworu skrobi. Następnie w równych odstępach czasu dodajemy α-amylazy. Zawartość probówek natychmiast mieszamy. Co 0,5 minuty przenosimy próby każdego z hydrolizatów na płytki z roztworem jodu w KJ. Powstające na płytkach zabarwienie wskazuje stopień rozkładu skrobi w danej próbie. Gdy jedna z nich w reakcji z jodem zabarwi się na jasnobrunatny kolor, należy w równych odstępach czasu dodać do wszystkich hydrolizatów 3 krople roztworu jodu w KJ. Natychmiast wymieszać zawartość probówek i obserwować powstałe zabarwienie.
Obserwacje:
pH |
Zabarwienie hydrolizatu w reakcji z jodem w KJ |
Stopień hydrolizy skrobi (rodzaj produktu) |
3 |
Granatowe |
Skrobia nierozłożona |
4 |
Fioletowe |
Amylodekstryny i erytrodekstryny |
5 |
Jasno-brązowe |
Amylodekstryny i Erytrodekstryny (przewaga) |
6 |
Średnio-brązowe |
Erytrodekstryny |
7 |
Fioletowe |
Amylodekstryny i erytrodekstryny |
8 |
Ciemno-granatowe |
Skrobia nierozłożona |
Wnioski:
- Kolor granatowy świadczy o tym iż skrobia nie została rozłożona co widać po probówkach z
zawartością pH=3 i pH=8.
- Probówki o pH= 4, pH=6 i pH=7 których kolory były ciemniejsze ukazują nam częściowe
rozłożenie skrobi.
- W probówce z zawartością pH=5 gdzie barwa miała najjaśniejszy odcień brązu świadczy o
tym iż hydroliza wpłynęła na nią najbardziej.
α-amylaza rozkłada tylko wewnętrzne wiązania α-1,4-glikozydowe, powodując stopniowe rozszczepianie łańcuchów na coraz krótsze fragmenty zwane dekstrynami. Przebieg tego etapu degradacji skrobi zwanego etapem dekstrynowania można śledzić dzięki barwnej reakcji z roztworem jodu w KJ, nierozłożonej skrobi i dłuższych dekstryn.
II. Wpływ temperatury.
Do koloidalnego roztworu skrobi dodajemy buforu o pH optymalnym dla działania badanego preparatu α-amylazy. Inkubujemy w ciągu 5 minut w różnych temperaturach. Po tym czasie dodajemy roztworu α-amylazy. Natychmiast mieszamy i ponownie inkubujemy w danych temperaturach w ciągu 3 minut. Następnie do probówki z DNS wprowadzamy mieszanine reakcyjną. Mieszamy i umieszczamy na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej, po czym schładzamy i dodajemy wody destylowanej. Mieszamy ponownie i mierzymy absorbancję roztworu wobec próby odczynnikowej zawierającej wodę destylowaną. Z krzywej wzorcowej odczytujemy stężenia cukrów redukujących w mieszaninie reakcyjnej w przeliczeniu na maltozę.
Obliczenia:
Temperatura Hydrolizy °C |
pokojowa |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
Stężenie cukrów redukujących mg maltozy/cm³ |
0,350 |
0,800 |
1,680 |
1,255 |
0,490 |
0,400 |
Wykres:
Wnioski:
Wraz ze wzrostem temperatury, stężenie cukrów redukujących w wykonanym ćwiczeniu wzrastało i stopniowo osiągnęło maksimum przy 50°C, po czym zaczęło spadać. W miarę oddalania się od wartości pH optymalnego (50°C), aktywność enzymu obniża się. Podwyższona temperatura osłabia, a po przekroczeniu pewnej wartości nawet niszczy niektóre słabe oddziaływania w molekule enzymu, co prowadzi do stopniowej denaturacji białka enzymatycznego.
III. Badanie termostabilności α-amylazy.
Do roztworu α-amylazy dodajemy buforu o pH optymalnym i inkubujemy w ciągu 10 minut w różnych temperaturach. Po 10 minutach roztwór enzymu schładzamy do temperatury pokojowej dodajemy roztworu skrobi po czym dokładnie mieszamy. Inkubujemy w ciągu 3 minut w temperaturze pokojowej po czym pobieramy mieszaninę reakcyjną i wprowadzamy do roztworu DNS. Mieszamy i umieszczamy na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej. Schładzamy, dodajemy wody destylowanej i ponownie dokładnie mieszamy. Mierzymy ekstrakcję roztworu wobec próby odczynnikowej zawierającej wodę destylowaną. Z krzywej wzorcowej odczytujemy stężenie cukrów redukujących w mieszaninie reakcyjnej.
Obliczenia:
Temperatura preinkubacji [°C] |
Pokojowa |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
Stężenie cukrów redukujących |
0,65
|
0,62 |
0,39 |
0,195 |
0,17 |
0,12 |
Wykres:
Wnioski:
Termostabilność jest to najwyższa temperatura przy której nie dochodzi do termicznej inaktywacji enzymu poddawanego działaniu tej temperatury w nieobecności substratu.
Termostabilność jest zależna od pH, siły jonowej, środowiska oraz obecności w nim różnych substancji niskocząsteczkowych.
10 minutowa preinkubacja nie spowodowała spadku aktywności α-amylazy w temperaturze 20°C (temperaturze pokojowej) do 40°. Powyżej tych temperatur zaczęła postępować denaturacja α-amylazy.
IV. Wpływ aktywatorów i inhibitorów na α-amylazę.
Do roztworu skrobi dodajemy:
Probówka 1 => wody destylowanej (+ α-amylazy śliny)
Probówka 2 => roztworu NaCl (+ α-amylazy śliny)
Probówka 3 => CuSO4 (+ α-amylazy śliny)
Następnie do wszystkich dodajemy roztworu α-amylazy śliny. Pobieramy z każdej probówki po kropli hydrolizatu. I przeprowadzamy reakcję z roztworem jodu w KJ. W chwili gdy próba jednego z hydrolizatów będzie dawała z jodem reakcję ujemną, dodajemy do wszystkich probówek 4 krople roztworu jodu w KJ i natychmiast mieszamy zawartość probówek.
Obserwaje:
Probówka 1 |
Wystąpiło odbarwienie na kolor fioletowo-niebieski.
|
Probówka 2 |
Wystąpiło odbarwienie na kolor jasno niebieski. |
Probówka 3 |
Wystąpiło odbarwienie na kolor ciemno granatowy. |
Wnioski:
Aktywatorami są jony Cl przyspieszając katalityczne działanie enzymu (aktywując α-amylazę śliny). Za inhibitory które opóźniają i obniżają aktywność enzymu posłużyły nam woda destylowana i CuSO4.
Bibliografia:
Instrukcja do ćwiczenia
Notatki