Klaudia Czuma
Martyna Malińska
Karolina Ostrowska
LABORATORIUM Z BIOCHEMII
TEMAT: BIAŁKA
Wykonano:16.10.2008r.
Oddano: 23.10.2008r.
I. WSTĘP TEORETYCZNY
Białka są to wielkocząsteczkowe (masa cząsteczkowa od ok. 10 do 1000 kDa) biopolimery zbudowane z ponad 100 do 10 000 reszt L-α-aminokwasów połączonych wiązaniem peptydowym, występujące we wszystkich organizmach roślinnych i zwierzęcych. Są zasadniczymi elementami metabolicznymi i strukturalnymi komórek, tkanek i narządów organizmów żywych. Syntetyzowane są częściowo z aminokwasów endogennych, które ustrój może sam wytwarzać, a poza tym z aminokwasów egzogennych tzw. istotnych, pobieranych z pokarmów rozkładanych w procesie trawienia. Dzielą się na proste (proteiny) i złożone (proteidy). Białka proste zbudowane są tylko z aminokwasów. Białka proste dzieli się na sferoproteiny(globularne, rozpuszczalne) i skleroproteiny (białka włókniste).
Do białek globularnych zalicza się:
gluteiny, rozpuszczalne w kwasach i zasadach; należą do nich białka bogate w kwas glutaminowy, występują w ziarnach zbóż;
prolaminy, rozpuszczalne w 70% roztworze alkoholu etylenowego; należą do nich białka bogate w kwas glutaminowy, występują w ziarnach zbóż;
histony, rozpuszczalne w wodzie i w rozcieńczonych kwasach;
protaminy, rozpuszczalne w wodzie, zasadowe; składowe części jąder komórkowych, czerwonych i białych ciałek krwi.
Skleroproteiny są to nierozpuszczalne białka szkieletowe, materiał budulcowy chrząstek, rogów, łusek, włosów itp. Należą do nich: fibroina (białko jedwabiu), kolagen (białko tkanki łącznej, ścięgna), keratyna (białko piór, włosów, kopyt, rogów). Białka złożone składają się z białek prostych (części białkowej) i grup o nieaminokwasowym charakterze (części niebiałkowej) zwanych grupami prostetycznymi.
W zależności od rodzaju grupy prostetycznej białka złożone dzieli się na:
fosforoproteidy, zawierające kwas ortofosforowy(V), nie koagulują na ciepło, lecz po zakwaszeniu; należy do nich kazeina;
glikoproteidy, zawierające pewne cukry, np. białko jaja kurzego;
chromoproteidy, zawierające atom metalu, np. hemoglobina, chlorofil;
lipoproteidy, zawierające związki o charakterze tłuszczów;
nukleoproteidy, zawierające nukleotydy, kwasy nukleinowe.
Białka złożone są bardziej rozpowszechnione w przyrodzie od protein. Do białek złożonych należą wszystkie enzymy. Strukturalne właściwości białek są rozważane w aspekcie czterech poziomów uorganizowania: struktury pierwszo-, drugo-, trzecio- i (jedynie dla białek oligomerycznych) czwartorzędowej. Struktura pierwszorzędowa, tj. sekwencja aminokwasów i lokalizacja wszystkich wiązań dwusiarczkowych, jest zakodowana w genach. Struktura drugo- i trzeciorzędowa, odnoszące się do konformacji białka dozwolonych przez wiązania peptydowe, są dyktowane przez strukturę pierwszorzędową. Strukturę drugorzędową stanowi zwinięcie łańcuchów polipeptydowych w konstrukcje uwarunkowane zwielokrotnionymi wiązaniami wodorowymi, takie jak helisa α i harmonijka β. Struktura trzeciorzędowa obejmuje oddziaływania między domenami struktury drugorzędowej i resztami aminokwasowymi znacznie oddalonymi w sensie struktury pierwszorzędowej. Struktura czwartorzędowa, obecnie jedynie w białkach mających dwa lub więcej łańcuchów polipeptydowych ( białka oligomeryczne), dotyczy punktów kontaktowych i innych powiązań między tymi polipeptydami lub podjednostkami.
Wspólne fizykochemiczne właściwości białek to:
- zbliżony skład pierwiastkowy
- roztwory białek są hydrofilowymi układami koloidalnymi
- roztwory białek nie ulęgają dializie, czyli nie dyfundują przez półprzepuszczalne przegrody
- są amfoterami - wiążą jony, migrują w polu elektrycznym
- ulegają wysalaniu, czyli wypadają z roztworu pod wpływem wysokich stężeń ok. 20 - 100% silnych elektrolitów
- ulegają wytrącaniu- wypadają z roztworu pod wpływem organicznych rozpuszczalników
- są to związki optycznie czynne, ich roztwory skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego oraz pochłaniają światło w zakresie ultrafioletu.
.
II. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
Rozpuszczalność i wysalanie
1. Izolowanie białek roślinnych
A) Ekstrahowanie albumin i globulin.
Wykonanie: 1 g mączki grochowej wyekstrahowno 25 ml 0,5 molowego roztworu KCl, w kolbie erlenmeyrce przez 15 minut po czym całość odwirowano i uzyskaną ciecz nadosadową analizowno na dwa sposoby:
a) reakcja biuretowa: do 2 ml badanego roztworu białka z mączki, roztworu białka kurzego i wody dodano 2 ml 10 % roztworu NaOH i kilka kropli 1% roztworu
.
Obserwacje: Pojawiło się niebiesko-fioletowe zabarwienie w obu probówkach świadczącego obecności białka. W probówce z wodą nie obserwujemy żadnych zmian.
b) stwierdzenie obecności albumin i globulin: do dwóch probówek dodano 1 ml ekstraktu mączki następnie do 1 probówki dodano 8 ml wody, a do drugiej 8 ml 0,5 molowego KCl. W próbie z wodą nastąpiło zmętnienie, więc zgodnie z przepisem dodano do niej kilka kropli KCl.
Obserwacje: Probówka z białkiem i KCl - roztwór klarowny.
Probówka z białkiem i wodą - mętny roztwór, po dodaniu KCl roztwór zaczął się klarować.
B) Wydzielanie glutenu
Wykonanie: Przygotowano twarde ciasto z 30g mąki pszennej i wody, które odstawiono na 15min, aby białko się uwodniło i spęczniało. Następnie wygniatano ciasto w strumieniu zimnej, bieżącej wody w celu wypłukania skrobi. Otrzymaną pozostałość o gumowatej, ciągnącej konsystencji rozpuszczono w 30ml 0,2M roztworu NaOH. Po przesączeniu sprawdzono obecność białka metodą biuretową. Równocześnie wykonuje daną próbę dla roztworu białka jaja kurzego i wody.
Obserwacje: W próbie z przygotowanej mączki pojawiło się niebiesko-czerwono-fioletowe zabarwienie co oznacza, że znajdowało się w niej białko- gluten. W probówce z białkiem jaja kurzego również, w probówce z wodą- roztwór klarowny o barwie niebieskiej.
2. Wysalanie białek
Wykonanie: Do 10ml roztworu białka jaja kurzego porcjami dodawano stały preparat
aż do nasycenia roztworu soli. Osad wydzielonego białka oddzielono na sączku. Do przesączu otrzymanego po oddzieleniu osadu białka dodano 3 krople 5%
aby sprawdzić obecność białka. Osad wydzielonego białka rozpuszczono roztworem 0,5M KCl. Następnie w uzyskanym roztworze sprawdzono obecność białka metodą biuretową(do 2 ml badanego roztworu białka dodano 2 ml 10% roztworu NaOH oraz 3 krople 1% roztworu CuSO4).
Obserwacje: W przesączu otrzymanym po oddzieleniu białka jaja kurzego nie wytrąciło się białko, nie było żadnego osadu.
W wyniku reakcji biuretowej, której poddano osad wysolonego białka pojawiło się niebiesko-czerwono-fioletowe zabarwienie, co świadczyło o dodatnim odczynie reakcji czyli obecności białka w próbie.
3.Białka jako koloidy.
Wykonanie: Do dwóch probówek dodano po 1 ml roztworu
. Do jednej probówki dodano 1 ml roztworu białka a do drugiej tą samą ilość wody. Po wymieszaniu dodano do każdej probówki roztwór NaCl.
Obserwacje: Probówka 1 - po dodaniu
- biała zawiesina białka, po dodaniu NaCl osad się rozpuścił.
Próbówka 2 - po dodaniu wody dodaniu nie zaobserwowano zmian, roztwór bezbarwny; po dodaniu NaCl tworzy się mętny mleczno-szary(fioletowy)roztwór (tworzy się AgCl ).
.
4. Amfoteryczność białek
Strącanie białek z kationów i anionów
Wykonanie: Do 3 probówek odmierzono po 2 ml roztworu białka jaja kurzego o odpowiednim pH. Do poszczególnych próbek dodawano kroplami wymienione w tabeli roztwory soli.
- oznacza brak osadu + oznacza powstanie osadu(białczanu)
Odczynniki |
1% roztwór białka jaja kurzego |
||
|
pH = 8,0 |
pH = 4,7 |
pH = 3,0 |
10% siarczan miedziowy |
+ |
— |
— |
10% octan ołowiu (II) |
+ |
— |
— |
10% wolframian sodowy |
— |
— |
+ |
B) Wpływ kwasów organicznych na białko
Wykonanie: do 3 probówek dodano po 1ml 1% roztworu białka jaja kurzego. Do poszczególnych próbek dodawano po 1ml wymienione w tabeli roztwory kwasów organicznych.
Intensywność strącania + lub -
KWAS |
OBSERWCJE |
6% kwas sulfanilowy |
+ |
5% kwas trójchlorooctowy |
+ |
5% kwas octowy |
— |
5.Denaturacja cieplna
Wykonanie: Do 3 probówek odmierzono po 2 ml roztworu białka jaja kurzego o pH kolejno: 8,0; 4,7 oraz 3,0. próby umieszczono na 15min. we wrzącej łaźni wodnej. Po schłodzeniu do prób zawierających roztwór białka o pH 3,0 oraz pH 8,0 dodano 5ml 0,1M roztworu buforu octanowego o pH 4,7.
Obserwacje: Po reakcji roztwór białka jaja kurzego o pH 3,0 był bezbarwny. W roztworze o pH 4,7 wytrąciło się zbite białko, unoszące się na powierzchni. W roztworze o pH 8,0 wystąpiło zmętnienie, mała ilość osadu wypadła z roztworu.
Po dodaniu buforu do roztworu białka jaja kurzego o pH 8,0 wytrąciła się duża ilość koloidalnego osadu- kłaczki na dnie. Natomiast w roztworze białka jaj kurzego o pH 3,0 wystąpiło zmętnienie i wytrąciła się mniejsza ilość koloidalnego osadu niż w roztworze białka o pH 8,0.
6. Reakcja biuretowa
Wykonanie: Do pierwszej probówki wlano 2 ml białka a do drugiej 2 ml wody, po czym do obu dodano 2 ml roztworu 10% roztworu NaOH oraz kilka kropli 2% roztworu
.
Obserwacje: W probówce z białkiem pojawiło się charakterystyczne niebiesko-fioletowe zabarwienie. Natomiast w próbce z wodą pojawiło się jasno niebieskie zabarwienie roztworu.
III. WNIOSKI
Większość białek( albumin) jest dobrze rozpuszczalna w wodzie, jednak niektóre proteiny wymagają do rozpuszczenia obecności jonów soli (globuliny). Te właściwości potwierdziło przeprowadzenie pierwszego doświadczenia- ekstrahowania albumin i globulin. W roztworze wodnym białka nastąpiło wypadanie globulin(zmętnienie) z powodu silnego momentu dipolowego cząsteczki i skłonności do tworzenia agregatów, rozpuściły się dopiero pod wpływem obecności jonów soli-wsalanie. Albuminy się rozpuściły, gdyż ich moment dipolowy jest mniejszy od globulinowego i wykazują powinowactwo do wody.
Reakcja biuretowa jest to jedna z najczęściej wykonywanych reakcji w analizie białek, pozwalająca je wykryć. W wyniku utworzenia koordynacyjnego połączenia miedzi Cu z dwoma przyległymi wiązaniami -CO-NH- peptydu/białka powstaje barwny kompleks (niebiesko-czerwono-fioletowy). Dzięki wykonaniu tej reakcji potwierdzono obecność białka w doświadczeniu pierwszym i drugim oraz glutenu.
Białka rozpuszczalne w wodzie można wytrącić z roztworu dużym stężeniem soli- wysalanie. Wysalanie polega na dehydratacji (likwidacji wodnej otoczki) cząsteczek białka. Do wysalania białek stosuje się sole, których jony łatwo tworzą wodziany(np. siarczany magnezu, sodu i amonu). W doświadczeniu drugim użyto siarczanu amonowego, otrzymano osad wysolonego białka. Wysalanie jest procesem odwracalnym. Do przesączu otrzymanego przez oddzielenie osadu białka i dodaniu TCA nie stwierdzono osadu-świadczy to o całkowitym wysoleniu białka.
Ze względu na obecność w cząsteczkach białek grup hydrofilowych (-COOH; -OH; =NH;-SH) oraz duży rozmiar ich molekuł roztwory tych substancji należą do właściwych układów koloidalnych zwanych emulsoidami lub koloidami. W rzeczywistości koloidy białkowe można traktować jako układy amofilne, ponieważ molekuły protein posiadają jednocześnie regiony hydrofilowe i hydrofobowe. Białka rozpuszczając się w środowisku wodnym, grupują się na hydrofilowych obszarach swoich makrocząsteczek dipolarne molekuły wody, tworząc wokół siebie otoczkę hydratacyjną. W zależności od ilości hydrofilowych regionów, cząsteczki białka mogą być całkowicie lub częściowo pokryte płaszczem wodnym. W wykonanym doświadczeniu wykonano dwie próby: z wodą- powstał biały koloid AgCl; z białkiem-otrzymano klarowny roztwór, ponieważ doszło do powstania soli AgCl, która jest czynnikiem hydrofobowym, a w połączeniu z białkiem tworzy koloid ochronny zabezpieczający je przed wypadaniem z roztworu.
Białka są związkami amfoterycznymi. Podstawowym elementem strukturalnym cząsteczki białkowej jest łańcuch polipeptydowy, zbudowany z aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniem peptydowym, tworzącym się w reakcji grupy -NH2 jednego aminokwasu z grupa -COOH drugiego aminokwasu. W cząsteczce białka grupami zdolnymi do jonizacji pozostają więc tylko grupy -COOH aminokwasów di karboksylowych, grupy -NH2 aminokwasów dwumianowych, nieznaczna liczba końcowych grup aminokwasowych i karboksylowych, grupa -OH tyrozyny, -SH cysteiny, reszta imidazolowi histydyny, guanidynowa argininy oraz fosforowa foso protein. Obecność tych grup nadaje cząsteczce białka charakter wielowartościowego jonu. Zarówno dysocjacja grup karboksylowych, jak i przydacznie jonów H+ do grup aminowych związanych z białkiem zależą od pH roztworu. Dla białek istnieje pojęcie punktu izoelektrycznego. Cząsteczka białkowa w pI staje się dipolem, o bardzo dużym momencie dipolowym. Białko wykorzystane w doświadczeniu ma swój punkt izoelektryczny w pH=4,7 czyli jest jonem obojnaczym, nie wiąże ani kationów ani anionów. W pH=8,0 biało jaja kurzego posiada znak ujemny i łączy się z kationami soli siarczanu miedzi i octanu ołowiu tworząc osad (białczan). Z kolei w pH=3,0 białko zachowuje się jak kation i łączy się z anionem soli wolframianu sodowego. Kationy metali ciężkich denaturują białka i tworzą z ich aminowa formą trudno rozpuszczalne, słabo dysocjujące sole. Białczany metali alkalicznych( np. Na+ lub K+) są dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie.
Niektóre kwasy organiczne(mocne) denaturują i tworzą z nimi trwałe, nierozpu-szczalne połączenia, dlatego kwas sulfosalicylowy i trójchlorooctowy wywołują denaturację (stosowane są do odbiałczania płynów biologicznych), zaś kwas octowy jako słaby nie powoduje zmiany w konformacji łańcucha polipeptydowego.
Denaturacja cieplna przeprowadzona w 3 probówkach z 3 różnymi wartościami pH białka jaja kurzego pozwoliła zaobserwować, iż nie zawsze białko zdenaturowane wypada w postaci osadu. W białku o pH=4,7 punkt izoelektryczny, najmniejsza rozpuszczalność, koagulacja białka. W probówce z białkiem o pH=8 rozpuszczalność była większa, niż w probówce o pH=3. Dodając buforu amonowego do roztworów o pH 3 i 8 doprowadzono do punktu izoelektrycznego(białko denaturowane ma inną wartość pI). Pod wpływem działania wysokiej temperatury doszło do trwałej destrukcji natywnej konformacji łańcucha makropeptydu, prowadzącą do utraty jego naturalnej biologicznej funkcji.