bialka spr(1), Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka


Klaudia Czuma

Martyna Malińska

Karolina Ostrowska

LABORATORIUM Z BIOCHEMII

TEMAT: BIAŁKA

Wykonano:16.10.2008r.

Oddano: 23.10.2008r.

I. WSTĘP TEORETYCZNY

Białka są to wielkocząsteczkowe (masa cząsteczkowa od ok. 10 do 1000 kDa) biopolimery zbudowane z ponad 100 do 10 000 reszt L-α-aminokwasów połączonych wiązaniem peptydowym, występujące we wszystkich organizmach roślinnych i zwierzęcych. Są zasadniczymi elementami metabolicznymi i strukturalnymi komórek, tkanek i narządów organizmów żywych. Syntetyzowane są częściowo z aminokwasów endogennych, które ustrój może sam wytwarzać, a poza tym z aminokwasów egzogennych tzw. istotnych, pobieranych z pokarmów rozkładanych w procesie trawienia. Dzielą się na proste (proteiny) i złożone (proteidy). Białka proste zbudowane są tylko z aminokwasów. Białka proste dzieli się na sferoproteiny(globularne, rozpuszczalne) i skleroproteiny (białka włókniste).

Do białek globularnych zalicza się:

  1. albuminy, rozpuszczalne w wodzie, trudno wysalające się; należą do nich białka roślinne, jaja kurzego, mleka; zawierają dużo aminokwasów siarkowych, nie zawierają glicyny;

  2. globuliny, nierozpuszczalne w wodzie, rozpuszczalne w rozcieńczonych roztworach soli, kwasów i zasad; należą do nich białka roślinne, surowicy krwi;

  3. gluteiny, rozpuszczalne w kwasach i zasadach; należą do nich białka bogate w kwas glutaminowy, występują w ziarnach zbóż;

  4. prolaminy, rozpuszczalne w 70% roztworze alkoholu etylenowego; należą do nich białka bogate w kwas glutaminowy, występują w ziarnach zbóż;

  5. histony, rozpuszczalne w wodzie i w rozcieńczonych kwasach;

  6. protaminy, rozpuszczalne w wodzie, zasadowe; składowe części jąder komórkowych, czerwonych i białych ciałek krwi.

Skleroproteiny są to nierozpuszczalne białka szkieletowe, materiał budulcowy chrząstek, rogów, łusek, włosów itp. Należą do nich: fibroina (białko jedwabiu), kolagen (białko tkanki łącznej, ścięgna), keratyna (białko piór, włosów, kopyt, rogów). Białka złożone składają się z białek prostych (części białkowej) i grup o nieaminokwasowym charakterze (części niebiałkowej) zwanych grupami prostetycznymi.

W zależności od rodzaju grupy prostetycznej białka złożone dzieli się na:

  1. fosforoproteidy, zawierające kwas ortofosforowy(V), nie koagulują na ciepło, lecz po zakwaszeniu; należy do nich kazeina;

  2. glikoproteidy, zawierające pewne cukry, np. białko jaja kurzego;

  3. chromoproteidy, zawierające atom metalu, np. hemoglobina, chlorofil;

  4. lipoproteidy, zawierające związki o charakterze tłuszczów;

  5. nukleoproteidy, zawierające nukleotydy, kwasy nukleinowe.

Białka złożone są bardziej rozpowszechnione w przyrodzie od protein. Do białek złożonych należą wszystkie enzymy. Strukturalne właściwości białek są rozważane w aspekcie czterech poziomów uorganizowania: struktury pierwszo-, drugo-, trzecio- i (jedynie dla białek oligomerycznych) czwartorzędowej. Struktura pierwszorzędowa, tj. sekwencja aminokwasów i lokalizacja wszystkich wiązań dwusiarczkowych, jest zakodowana w genach. Struktura drugo- i trzeciorzędowa, odnoszące się do konformacji białka dozwolonych przez wiązania peptydowe, są dyktowane przez strukturę pierwszorzędową. Strukturę drugorzędową stanowi zwinięcie łańcuchów polipeptydowych w konstrukcje uwarunkowane zwielokrotnionymi wiązaniami wodorowymi, takie jak helisa α i harmonijka β. Struktura trzeciorzędowa obejmuje oddziaływania między domenami struktury drugorzędowej i resztami aminokwasowymi znacznie oddalonymi w sensie struktury pierwszorzędowej. Struktura czwartorzędowa, obecnie jedynie w białkach mających dwa lub więcej łańcuchów polipeptydowych ( białka oligomeryczne), dotyczy punktów kontaktowych i innych powiązań między tymi polipeptydami lub podjednostkami.

Wspólne fizykochemiczne właściwości białek to:

- zbliżony skład pierwiastkowy

- roztwory białek są hydrofilowymi układami koloidalnymi

- roztwory białek nie ulęgają dializie, czyli nie dyfundują przez półprzepuszczalne przegrody

- są amfoterami - wiążą jony, migrują w polu elektrycznym

- ulegają wysalaniu, czyli wypadają z roztworu pod wpływem wysokich stężeń ok. 20 - 100% silnych elektrolitów

- ulegają wytrącaniu- wypadają z roztworu pod wpływem organicznych rozpuszczalników

- są to związki optycznie czynne, ich roztwory skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego oraz pochłaniają światło w zakresie ultrafioletu.

.

II. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

Rozpuszczalność i wysalanie

1. Izolowanie białek roślinnych

A) Ekstrahowanie albumin i globulin.

Wykonanie: 1 g mączki grochowej wyekstrahowno 25 ml 0,5 molowego roztworu KCl, w kolbie erlenmeyrce przez 15 minut po czym całość odwirowano i uzyskaną ciecz nadosadową analizowno na dwa sposoby:

a) reakcja biuretowa: do 2 ml badanego roztworu białka z mączki, roztworu białka kurzego i wody dodano 2 ml 10 % roztworu NaOH i kilka kropli 1% roztworu 0x01 graphic
.

Obserwacje: Pojawiło się niebiesko-fioletowe zabarwienie w obu probówkach świadczącego obecności białka. W probówce z wodą nie obserwujemy żadnych zmian.

b) stwierdzenie obecności albumin i globulin: do dwóch probówek dodano 1 ml ekstraktu mączki następnie do 1 probówki dodano 8 ml wody, a do drugiej 8 ml 0,5 molowego KCl. W próbie z wodą nastąpiło zmętnienie, więc zgodnie z przepisem dodano do niej kilka kropli KCl.

Obserwacje: Probówka z białkiem i KCl - roztwór klarowny.

Probówka z białkiem i wodą - mętny roztwór, po dodaniu KCl roztwór zaczął się klarować.

B) Wydzielanie glutenu

Wykonanie: Przygotowano twarde ciasto z 30g mąki pszennej i wody, które odstawiono na 15min, aby białko się uwodniło i spęczniało. Następnie wygniatano ciasto w strumieniu zimnej, bieżącej wody w celu wypłukania skrobi. Otrzymaną pozostałość o gumowatej, ciągnącej konsystencji rozpuszczono w 30ml 0,2M roztworu NaOH. Po przesączeniu sprawdzono obecność białka metodą biuretową. Równocześnie wykonuje daną próbę dla roztworu białka jaja kurzego i wody.

Obserwacje: W próbie z przygotowanej mączki pojawiło się niebiesko-czerwono-fioletowe zabarwienie co oznacza, że znajdowało się w niej białko- gluten. W probówce z białkiem jaja kurzego również, w probówce z wodą- roztwór klarowny o barwie niebieskiej.

2. Wysalanie białek

Wykonanie: Do 10ml roztworu białka jaja kurzego porcjami dodawano stały preparat 0x01 graphic
aż do nasycenia roztworu soli. Osad wydzielonego białka oddzielono na sączku. Do przesączu otrzymanego po oddzieleniu osadu białka dodano 3 krople 5% 0x01 graphic
aby sprawdzić obecność białka. Osad wydzielonego białka rozpuszczono roztworem 0,5M KCl. Następnie w uzyskanym roztworze sprawdzono obecność białka metodą biuretową(do 2 ml badanego roztworu białka dodano 2 ml 10% roztworu NaOH oraz 3 krople 1% roztworu CuSO4).

Obserwacje: W przesączu otrzymanym po oddzieleniu białka jaja kurzego nie wytrąciło się białko, nie było żadnego osadu.

W wyniku reakcji biuretowej, której poddano osad wysolonego białka pojawiło się niebiesko-czerwono-fioletowe zabarwienie, co świadczyło o dodatnim odczynie reakcji czyli obecności białka w próbie.

3.Białka jako koloidy.

Wykonanie: Do dwóch probówek dodano po 1 ml roztworu 0x01 graphic
. Do jednej probówki dodano 1 ml roztworu białka a do drugiej tą samą ilość wody. Po wymieszaniu dodano do każdej probówki roztwór NaCl.

Obserwacje: Probówka 1 - po dodaniu 0x01 graphic
- biała zawiesina białka, po dodaniu NaCl osad się rozpuścił.

Próbówka 2 - po dodaniu wody dodaniu nie zaobserwowano zmian, roztwór bezbarwny; po dodaniu NaCl tworzy się mętny mleczno-szary(fioletowy)roztwór (tworzy się AgCl ).

.

4. Amfoteryczność białek

  1. Strącanie białek z kationów i anionów

Wykonanie: Do 3 probówek odmierzono po 2 ml roztworu białka jaja kurzego o odpowiednim pH. Do poszczególnych próbek dodawano kroplami wymienione w tabeli roztwory soli.

- oznacza brak osadu + oznacza powstanie osadu(białczanu)

Odczynniki

1% roztwór białka jaja kurzego

pH = 8,0

pH = 4,7

pH = 3,0

10% siarczan miedziowy

+

10% octan ołowiu (II)

+

10% wolframian sodowy

+

B) Wpływ kwasów organicznych na białko

Wykonanie: do 3 probówek dodano po 1ml 1% roztworu białka jaja kurzego. Do poszczególnych próbek dodawano po 1ml wymienione w tabeli roztwory kwasów organicznych.

Intensywność strącania + lub -

KWAS

OBSERWCJE

6% kwas sulfanilowy

+

5% kwas trójchlorooctowy

+

5% kwas octowy

5.Denaturacja cieplna

Wykonanie: Do 3 probówek odmierzono po 2 ml roztworu białka jaja kurzego o pH kolejno: 8,0; 4,7 oraz 3,0. próby umieszczono na 15min. we wrzącej łaźni wodnej. Po schłodzeniu do prób zawierających roztwór białka o pH 3,0 oraz pH 8,0 dodano 5ml 0,1M roztworu buforu octanowego o pH 4,7.

Obserwacje: Po reakcji roztwór białka jaja kurzego o pH 3,0 był bezbarwny. W roztworze o pH 4,7 wytrąciło się zbite białko, unoszące się na powierzchni. W roztworze o pH 8,0 wystąpiło zmętnienie, mała ilość osadu wypadła z roztworu.

Po dodaniu buforu do roztworu białka jaja kurzego o pH 8,0 wytrąciła się duża ilość koloidalnego osadu- kłaczki na dnie. Natomiast w roztworze białka jaj kurzego o pH 3,0 wystąpiło zmętnienie i wytrąciła się mniejsza ilość koloidalnego osadu niż w roztworze białka o pH 8,0.

6. Reakcja biuretowa

Wykonanie: Do pierwszej probówki wlano 2 ml białka a do drugiej 2 ml wody, po czym do obu dodano 2 ml roztworu 10% roztworu NaOH oraz kilka kropli 2% roztworu 0x01 graphic
.

Obserwacje: W probówce z białkiem pojawiło się charakterystyczne niebiesko-fioletowe zabarwienie. Natomiast w próbce z wodą pojawiło się jasno niebieskie zabarwienie roztworu.

III. WNIOSKI

Większość białek( albumin) jest dobrze rozpuszczalna w wodzie, jednak niektóre proteiny wymagają do rozpuszczenia obecności jonów soli (globuliny). Te właściwości potwierdziło przeprowadzenie pierwszego doświadczenia- ekstrahowania albumin i globulin. W roztworze wodnym białka nastąpiło wypadanie globulin(zmętnienie) z powodu silnego momentu dipolowego cząsteczki i skłonności do tworzenia agregatów, rozpuściły się dopiero pod wpływem obecności jonów soli-wsalanie. Albuminy się rozpuściły, gdyż ich moment dipolowy jest mniejszy od globulinowego i wykazują powinowactwo do wody.

Reakcja biuretowa jest to jedna z najczęściej wykonywanych reakcji w analizie białek, pozwalająca je wykryć. W wyniku utworzenia koordynacyjnego połączenia miedzi Cu z dwoma przyległymi wiązaniami -CO-NH- peptydu/białka powstaje barwny kompleks (niebiesko-czerwono-fioletowy). Dzięki wykonaniu tej reakcji potwierdzono obecność białka w doświadczeniu pierwszym i drugim oraz glutenu.

Białka rozpuszczalne w wodzie można wytrącić z roztworu dużym stężeniem soli- wysalanie. Wysalanie polega na dehydratacji (likwidacji wodnej otoczki) cząsteczek białka. Do wysalania białek stosuje się sole, których jony łatwo tworzą wodziany(np. siarczany magnezu, sodu i amonu). W doświadczeniu drugim użyto siarczanu amonowego, otrzymano osad wysolonego białka. Wysalanie jest procesem odwracalnym. Do przesączu otrzymanego przez oddzielenie osadu białka i dodaniu TCA nie stwierdzono osadu-świadczy to o całkowitym wysoleniu białka.

Ze względu na obecność w cząsteczkach białek grup hydrofilowych (-COOH; -OH; =NH;-SH) oraz duży rozmiar ich molekuł roztwory tych substancji należą do właściwych układów koloidalnych zwanych emulsoidami lub koloidami. W rzeczywistości koloidy białkowe można traktować jako układy amofilne, ponieważ molekuły protein posiadają jednocześnie regiony hydrofilowe i hydrofobowe. Białka rozpuszczając się w środowisku wodnym, grupują się na hydrofilowych obszarach swoich makrocząsteczek dipolarne molekuły wody, tworząc wokół siebie otoczkę hydratacyjną. W zależności od ilości hydrofilowych regionów, cząsteczki białka mogą być całkowicie lub częściowo pokryte płaszczem wodnym. W wykonanym doświadczeniu wykonano dwie próby: z wodą- powstał biały koloid AgCl; z białkiem-otrzymano klarowny roztwór, ponieważ doszło do powstania soli AgCl, która jest czynnikiem hydrofobowym, a w połączeniu z białkiem tworzy koloid ochronny zabezpieczający je przed wypadaniem z roztworu.

Białka są związkami amfoterycznymi. Podstawowym elementem strukturalnym cząsteczki białkowej jest łańcuch polipeptydowy, zbudowany z aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniem peptydowym, tworzącym się w reakcji grupy -NH2 jednego aminokwasu z grupa -COOH drugiego aminokwasu. W cząsteczce białka grupami zdolnymi do jonizacji pozostają więc tylko grupy -COOH aminokwasów di karboksylowych, grupy -NH2 aminokwasów dwumianowych, nieznaczna liczba końcowych grup aminokwasowych i karboksylowych, grupa -OH tyrozyny, -SH cysteiny, reszta imidazolowi histydyny, guanidynowa argininy oraz fosforowa foso protein. Obecność tych grup nadaje cząsteczce białka charakter wielowartościowego jonu. Zarówno dysocjacja grup karboksylowych, jak i przydacznie jonów H+ do grup aminowych związanych z białkiem zależą od pH roztworu. Dla białek istnieje pojęcie punktu izoelektrycznego. Cząsteczka białkowa w pI staje się dipolem, o bardzo dużym momencie dipolowym. Białko wykorzystane w doświadczeniu ma swój punkt izoelektryczny w pH=4,7 czyli jest jonem obojnaczym, nie wiąże ani kationów ani anionów. W pH=8,0 biało jaja kurzego posiada znak ujemny i łączy się z kationami soli siarczanu miedzi i octanu ołowiu tworząc osad (białczan). Z kolei w pH=3,0 białko zachowuje się jak kation i łączy się z anionem soli wolframianu sodowego. Kationy metali ciężkich denaturują białka i tworzą z ich aminowa formą trudno rozpuszczalne, słabo dysocjujące sole. Białczany metali alkalicznych( np. Na+ lub K+) są dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie.

Niektóre kwasy organiczne(mocne) denaturują i tworzą z nimi trwałe, nierozpu-szczalne połączenia, dlatego kwas sulfosalicylowy i trójchlorooctowy wywołują denaturację (stosowane są do odbiałczania płynów biologicznych), zaś kwas octowy jako słaby nie powoduje zmiany w konformacji łańcucha polipeptydowego.

Denaturacja cieplna przeprowadzona w 3 probówkach z 3 różnymi wartościami pH białka jaja kurzego pozwoliła zaobserwować, iż nie zawsze białko zdenaturowane wypada w postaci osadu. W białku o pH=4,7 punkt izoelektryczny, najmniejsza rozpuszczalność, koagulacja białka. W probówce z białkiem o pH=8 rozpuszczalność była większa, niż w probówce o pH=3. Dodając buforu amonowego do roztworów o pH 3 i 8 doprowadzono do punktu izoelektrycznego(białko denaturowane ma inną wartość pI). Pod wpływem działania wysokiej temperatury doszło do trwałej destrukcji natywnej konformacji łańcucha makropeptydu, prowadzącą do utraty jego naturalnej biologicznej funkcji.



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Zadanie koncowe, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
Ćwiczenie nr2, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
Zadanie końcowe, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
sprEnzymyII, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
sprKwasy nukleinowe, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
LABORATORIUM 4(1), Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
LABORATORIUM Z BIOCHEMII 3(1), Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
sprAminokwasy, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
enzymy - sprawozdanie, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
Ćwieczenie nr8, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
Ćwiczenie nr5, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
sprOksydoreduktazy, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
SPRAWOZDANIE 1 AMINOKWASY, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
kwasy nukleinowe, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
Zadanie koncowe, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
Ćwiczenie nr2, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
tabEnzymy, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki
tabKinetykaEnzymów, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki
GRUBOŚĆ STRUNY, Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Fizyka, Laborki, sprawka

więcej podobnych podstron