METODY BADAWCZE W BADANIACH ŻYWNOŚCI
1.Metody immunoenzymatyczne - elisa.
2.Metody chemiczne i biochemiczne:- chromatografia : gazowa ,cieczowa ,cienkowarstwowa
-elektoroogniskowanie
3.Metody genetyczne : -PCR - Real time PCR -metody mikrobiologiczne .
ELISA - enzyme -linked immunosorbet assai
1.Należy do najczęściej stosowanych testów w badaniach medycznych ,naukowych i diagnostycznych .
2. ZALETY :-prostota wykonania nawet przez osoby o małym przygotowaniu laboratoryjnym
-niewielkie wymagania sprzętowe
-bardzo duża czułość i swoistość
-duża powtarzalność
-niewielkie narażenie na błędy wykonania
3.WADY:-konieczność korzystania z zestawów diagnostycznych przygotowanych firmowo
-w przypadku badań żywności wyniki testu są uzależnione od sposobu przetworzenia produktu.
ZASADA METODY:
-metoda oparta na reakcji antygen - przeciwciało (poszukiwana substancja jest antygenem)
-interpretacja wyniku oparta jest o zmianę barwy z bezbarwnego substratu w barwny produkt
-analiza jakościowo - ilościowa
CHARAKTERYSTYKA ANTYGENU.1.Wprowadzenie do organizmu droga pozajelitową powoduje powstanie w nim swoistych białek zwanych przeciwciałami
2.Reaguje z tymi przeciwciałami łącząc się z nimi ,tworząc kompleksy.
3.Na antygenie jest wiele miejsc które mogą łączyć się z przeciwciałami nazywamy je EPITOPAMI lub HAPTENAMI
4.Reakcja antygen przeciwciało jest reakcją bardzo swoistą.
5.Przeciwciała wykrywają nawet bardzo niewielkie zmiany w strukturze antygenu.
6.Właściwości antygenu mają białka, w mniejszym stopniu wielocukry ,tłuszcze nie maja właściwości antygenu. Wł antygenu mogą mieć prostsze zw chemiczne.
7.Przeciwciała otrzymuje się immunizując (szczepiąc) antygenami zwierzęta doświadczalne.
8.Org zwierzęcia po 10dniach zaczyna wytwarzać przeciwciała .Są to przeciwciała o różnej swoistości tak, że w surowicy immunizowanego zwierzęcia jest mieszanina przeciwciał o bardzo różnym powinowactwie do antygenu.
9.Przeciwciala produkują komórki plazmatyczne .Jedna kom produkuje jeden rodzaj przeciwciał.
SANDWICH ELISA- metoda podwójnego wiązania .
Zasada oznaczenia w teście sandwicz elisa
-do dna studzienki przytwierdzone jest specyficzne przeciwciało
-dodajemy antygen .Jeśli w badanej próbce jest poszukiwany przez nas antygen połączy się on z przytwierdzonymi przeciwciałami
-inkubujemy w odpowiedniej tem
-przepłukujemy płytkę aby opłukac nadmiar badanej próbki
-dodajemy swoiste przeciwciało znakowane enzymem i ponownie inkubujemy
-jeśli w pierwszym etapie doszło do połączenia antygenu z przeciwciałami do tego kompleksu przyłączy się także znakowane enzymem przeciwciało
-w ten sposób powstaje kompleks przeciwciało - antygen - przeciwciało
-przepłukujemy płytkę aby usunąć nadmiar przeciwciał które nie połączyly się w kompleksy
-dodajemy substrat który reaguje z enzymem i powstaje barwny produkt
- reakcja jest bardzo czuła bowiem nawet niewielka ilość enzymu w kompleksie jest w stanie wytworzyć widoczny barwny produkt
STOSOWANE ENZYMY W TESCIE `SANDWICH ELISA'
-fosfataza alkaliczna - substrat- fosforan p-nitrofenolu
-peroksydaza chrzanowa- substrat - tetrametylobenzydyna
-oksydaza glukozowa - substrat - kwas5-aminosalicynowy
ZASTOSOWANIE TESTU ELISA DO BADAN ZYWNOSCI-wykrywanie GMO
-wykrywanie alergenów, toksyn bakteryjnych, patogenów bakteryjnych i pasożytniczych ,wykrywanie alfatoksyn ,środków ochrony roślin, histaminy, i amin biogennych, pozostałości dezynfekatów
ORGANIZMY MODYFIKOWANE GENETYCZNIE GMO -organizmy transgeniczne -są to organizmy do których materiału genetycznego zostały wprowadzone obce geny za pomocą metod nienaturalnych
PRZENOSZENIE GENU-
*Bezpośrednim -mechaniczne wprowadzenie transgenu do komórek biorcy
-mikrowstrzeliwanie
-elektropolacja
-mikroiniekcja
*Pośrednie -wykorzystanie pośrednictwa wcześniej konstruowanego wektora
-wirus , -bakteriofag ,-plazmid
ZASADY PRZENOSZENIA MATERIALU GENETYCZNEGO METODAMI INZYNIERII GENETYCZNEJ *Identyfikacja genu kodującego interesujący nas produkt
*Odczytanie sekwencji genu i jego zlokalizowanie
*Namnożenie genu przeznaczonego do transgenizacji czyli uzyskanie jego wielu kopi
*Przenoszenie zidentyfikowanego genu do organizmu transgenicznego
-podstawy uzyskania transgenu
*Uzyskanie DNA z którego chcemy pozyskac żądany przez nas gen
-enzym restrykcyjny ,kwasy nukleinowe w ściśle określonych miejscach
GMO- bakterii , drożdże ,pleśnie, rośliny i zwierzęta.
WYKORZYSTANIE GMO:
-rolnictwo-wolniejsze wykorzystanie owoców
-wartość odżywcza - mniejsza zawartość azotanów , większa zawartość skrobi , większy poziom amin olejów
-farmacja żeby roślinność nie była alergiczna ,produkcja szczepionek wbudowanych w rośliny ,tytoń syntetyzujący hemoglobinę
ZASTRZEZENIA CO DO GMO
1.Genetyczne- przemieszczenie genów na inne organizmy ,szczególnie geny antybiotyków - odporność
2.Ekologiczne - rozpełżnięcie się zmienionych organizmów po świecie
3.Zdrowotne -alergie ,rakotwórcze
4.Etyczne działanie przeciw naturze
5.Powstanie w GMO związków toksycznych dla innych organizmów
ZAGROŻENIA GMO
1.Interakcja z ludzka mikroflorą
2.Modyfikacja endogennych komponentów
3.Zmiany kwasów żółciowych
4.Zwiększenie toksyczności ksenobiotyków
5.Produkcja niezidentyfikowanych składników
ZAGROZENIA GMO MIKROBIOLOGICZNE
-Łatwość przekazywania materiału genetycznego pomiędzy rodziną i gatunkiem
-Bardzo szybkie rozmnażanie
-Łatwe ukrycie manipulacjami genetycznymi
-Możliwość wydostania się GMO z mikroorganizmu do środowiska
-bardzo trudne do przewidzenia skutki biologiczne ,medyczne i ekologiczne