Wyjaławianie pożywki z dodatkiem substancji łatwo rozpuszczających się np. mleko kokosowe.
1. sterylizacja termiczna w autoklawie
- temp. 119
- nadciśnienie 0,8
- 15 min.
2. Filtracja
- w podciśnieniu
- w nadciśnieniu
Warunki środowiska w fitotronie
1. natężenie światła
- kultury kalusa - całkowita ciemność
- kultury zarodników i protoplastów - światło 50-100Lx
- inicjacja wzrostu i organogeneza - światło 1000-3000Lx
- adaptacja roślin do szklarni - światła 3000-10000Lx
2. widmo światła
* światło niebieskie i bliski ultrafiolet (430-470nm)
- inicjacja różnicowania się pędów
- nadmiar ultrafioletu rozkłada kwasy nukleinowe
* światło czerwone (660nm)
- aktywuje cytokininy i tworzenie się nowych pędów
* daleka czerwień (740nm)
- sprzyja ukorzenianiu się pędów
W praktyce - lampy fluorescencyjne (od White, Flora) TLD 33 - światło białe, TLD 54 - światło dzienne
3. Fotoperiod:
- kultury kalusa ciemność 24h
- organogeneza - światło 12-16h
- organogeneza zbóż - światło 9-11h
- protokormy storczyków - światło 24h
4. temperatura
- zarodki jęczmienia -18oC - ciemność 24h, 20-22oC - światło 16h
- izobaty roślin cebulowych - 12-15 oC - 3 miesiące, 5 oC- 6 tyg
- eksplantaty begonii 18-21 oC
- merystemy truskawek 25 oC
- drzewa cytrusowe 25-30 oC
METODY ROZMNAŻANIA WEGETATYWNEGO IN VITRO
Mikrorozmnażanie
Sposoby rozmnażania roślin ogrodniczych:
pobudzanie do rozwoju pąków bocznych - wydajność 2-20 pąków bocznych
formowanie pąków bocznych bezpośrednio
formowanie paków przybyszowych pośrednio przez kalus
embriogeneza somatyczna
Kultura pędów bocznych (pachwinowych)
Metoda stosowana dla rozmnażania niektórych roślin ogrodowych:
gerbera, spathiphyllus, nephrolepis, orchidaeae
fragaria ananas, malus domestica
KULTURA PĄKÓW PRZYBYSZOWYCH
Pąki przybyszowe mogą być tworzone na różnych organach roślin - korzeniach, łodygach i liściach.
Metoda stosowana dla roślin:
- cebulowych (liliace, irydaceae, amarylidaceae)
- gesneriaceae (aeschylnanthus, episcira)
- begoniaceae (begonia)
Etapy organogenezy pąków przybyszowych:
- indukcja
- formowanie pąków pędowych
- rozwój pędów
- ukorzenianie
Różnicowanie pąków przybyszowych:
bezpośrednie formowanie pąków przybyszowych
inicjacja kalusa
kultury płynne
EMBRIOGENEZA SOMATYCZNA
Zarodki somatyczne:
formują się in vitro z komórek wegetatywnych
maja polarną strukturę pęd-korzeń
embriogenia może być każda żywa komórka
* najlepsze są eksplantaty izolowane z:
- młodych liści
Hipokotyli i liścieni siewek
Nierozwiniętych pędów kwiatowych
Inicjacja kalusa embriogennego:
- auksyna = 2,4D lub Picloron, rzadziej NAN i IAA
- niskie pH pożywki (4,0pH)=1-5nM NH4CL
- kwas salicylowy
- antybiotyki
rozwój zarodków (stadia globularne, sercowate i torpedy)
- pożywka pozbawiana auksyn
- dodatek cytokinin
* stymuluje proliferację tkanki embrionalnej i regenerację zarodków
* hamuje jednak potencjał embriogenności w komórkach
kiełkowanie zarodków i uzyskanie roślin (konwersja)
- pożywka pozbawiona regulatorów wzrostu
- lub z dodatkiem cytokinin
dojrzewanie zarodków
- dodatek kwasu abscysynowego (ABA) - poprawa jakości zarodków
Warunki wewnętrzne w fitotronie
- indukcja - w ciemności lub na świetle czerwonym
- kiełkowanie zarodków rośliny (konwersja) na świetle
Produkcja na skalę komercyjną w USA:
- pseudotsuga meniesi
- pinus taeda
Embriogeneza somatyczna cyklamena:
- wykorzystanie: produkcja materiału siewnego bardzo wysokiej jakości
- wydajność - 40tyś. Sz. Zarodków w 1dm3 pożywki w czasie 10tyg.
Koszty bezpośrednie mikrorozmnażania:
- robocizna 63-85%
- materiały 19%
- amortyzacja 13%
Koszty produkcji roślin in vitro:
- rośliny ozdobne i drzewiaste - koszt metod tradycyjnych
- warzywa = 3-10razy wyższy od metod tradycyjnych
RODZAJE KULTUR STERYLNYCH
Prakultury - zespół zabiegów przygotowujących całe rośliny, ich części lub wyizolowane eksplantaty do wprowadzenia in vitro.
Cele:
odmłodzenie eksplantatów
uwolnienie od drobnoustrojów
termoterapia organów (bulw, kłączy, pędów, nasion) uwalnia od wirusów, bakterii, grzybów, nicieni i owadów.
Dezynfekcja materiału roślinnego:
mycie w bieżącej wodzie 60min. - zmywanie bakterii epifitycznych
odtłuszczanie powierzchni - 70% etanol w czasie 0,5-30min.
odkażanie
- podchloryn sodu Nacl - 0,5%Cl w czasie 30min. (15-90)
- podchloryn wapnia Ca(OCl)2
- chloramina T
- alcie - bakterie
- expor - grzyby
- H2O2
WSPOMAGANIE SEZYNFEKCJI MATERIAŁU ROSLINNEGO
technika laserowa
ultradźwięki
fungicydy
antybiotyki -penicylina, siarczan streptomycyny
Kultura kalusa
Kalus= tkanka przyranna
- stale dzieląca się niezorganizowana tkanka
- tkanka o wyglądzie bezpostaciowej masy
- powstaje w naturze w skutek uszkodzenia mechanicznego.
Tkanki z jakich powstaje kalus w naturze:
- kambium (miazga łykodrzewna) np. młode łodygi winogron
- komórki rdzenia np. łodyga niecierpka
Indukcja tworzenia kalusa in vitro
W kulturze in vitro można zainicjować wytworzenie kalusa z dowolnego organu z tkanki poprzez:
- zranienie tkanki
- umieszczenie na pożywce z auksyną
Łatwość tworzenia kalusa zależy od:
- wyboru eksplantatu:
* fragmenty młodych łodyg, korzeni i liści
* fragmenty nasion i zarodków
* kambium waskularne
* protoplasty mezofilu
- fizjologii eksplantatu i jego wieku ontogenicznego (rozwoju osobniczego)
- sezonu pobierania eksplantatu
- wielkości eksplantatu
- lokalizacji w organie (im bliżej pąka szczytowego tym więcej auksyn)
- ogólnej kondycji rośliny - turgor
KULTURY POJEDYNCZYCH KOMÓREK
Cel kultury: otrzymanie klony pojedynczej, wyodrębnionej komórki, który może być użyty do badań morfogenetycznych.
Metody hodowli komórek:
na mostku z bibuły filtracyjnej (kwadracik bibuły nasączonej pożywką i metabolitami tkanki tego samego gatunku)
w wiszącej kropli (umieszczenie pod szkiełkiem przedmiotowym)
w mikrokomorach
w szalkach petriego
na mikropłytkach - pojemnik z wgłębieniem na dnie
Czynniki decydujące o optymalnym wzroście komórek:
równowaga jonów w pożywce
warunki osmotyczne środowiska
właściwe zbuforowanie pożywki (kwaśne i zasadowe fosforany)
KULTURA ZAWIESIN KOMÓRKOWYCH powstaje z:
luźnej, mało zróżnicowanej tkanki kalusowej poddanej dyspersji przez wstrząsanie
macerowanych tkanek merystematycznych
izolowanych mechanicznie komórek perynchemy
Metody utrzymania zawiesin w ciągłym ruchu:
- wolne obracanie
- wstrząsanie
- wirowanie
- mieszanie
Fazy wzrostu zawiesiny:
wzrostu opróżnionego (spoczynkowa) komórki nie dzielą się na świeżej pożywce
wzrostu wykładniczego (osiąganie maksymalnej liczby podziałów komórkowych)
wzrostu liniowego - komórki silnie rosną
stacjonarna - liczba komórek jest stała lub maleje
System hodowli zawiesiny:
kultura okresowa - jednorazowe wprowadzenie pożywki do naczynia
kultura okresowego dolewania - system półciągły
kultura ciągła
- kultura w obiegu zamkniętym - bioreaktory membranowe
- pożywka w obiegu otwartym - ustabilizowana gęstość populacji komórek
KULTURY ORGANÓW
Cel kultury:
organogeneza bezpośrednia, stabilna genetycznie
- z merystemów wierzchołkowych, korzenia i pędu
- z merystemów bocznych (kątowych, pachwinowych) łodyg i liści.
KULTURA ODCIĘTYCH KORZENI
Cel:
obserwacja rozprzestrzeniania się wirusów w korzeniach
pozyskiwanie wtórnych metabolitów roślinnych z kultur ukorzenionych dla celów farmaceutycznych
niezbędne dodatki do pożywki mineralnej:
- auksyny
- sacharoza
- witaminy: B1, B6, PP
KULTURA WIERZCHOŁKÓW I PĄKÓW BOCZNYCH PĘDÓW
Cel:
uzyskanie roślin wolnych od wirusów
mikrorozmnażanie
indukowanie poliploidalności kolchicyną
przechowywanie merystemów w ciekłym azocie (-196OC)
Rodzaje wzrostów
- wydłużony
- rozetowy
KULTURA ODCIĘTYCH LIŚCI
Cel - masowe rozmnażanie roślin
Izolacja:
ogonka liściowego
nasady blaszki liściowej
części środkowej i wierzchołkowej liścia
KULTURY ORGANÓW SPICHRZOWYCH
Cel - masowe rozmnażanie roślin np. narcyzy, tulipany, hiacynty, lilie
Izolacja:
fragmentów cebul
fragmentów pojedynczych lub podwójnych łusek
wycinków bulw lub kłączy
KULTURA ZARODKÓW
Cel:
rozmnażanie roślin uzyskanych w wyniku krzyżowania międzygatunkowego
przerywanie okresu spoczynku nasion i uzyskanie roślin
FAZY ROZWOJOWE ZARODKÓW
Kultura zarodków niedojrzałych
faza heterotroficzna - od fazy zygoty do stadium kulistego (prazarodek)
faza autotroficzna - od stadium sercowego
Kultura zarodków dojrzałych
Stadia rozwojowe zarodka: kuliste, sercowate, wczesna torpeda, torpeda, późna torpeda, laska, dojrzałe
Kultura prazarodków - zróżnicowane wymagania odżywcze
KULTURA ZALĄŻKÓW
Cel -łatwiejsze przenoszenie do pożywek:
- całych zalążków zawierających zarodki we wczesnej fazie embriogenezy (storczyki)
- zalążni lub zarodków - fragmenty łożyska
- niezapłodnionych zalążków - ginogeneza, jęczmień, gerbera, cebula.