Wyjaławianie pożywki z dodatkiem substancji łatwo rozpuszczających się np. mleko kokosowe.

1. sterylizacja termiczna w autoklawie

- temp. 119

- nadciśnienie 0,8

- 15 min.

2. Filtracja

- w podciśnieniu

- w nadciśnieniu

Warunki środowiska w fitotronie

1. natężenie światła

- kultury kalusa - całkowita ciemność

- kultury zarodników i protoplastów - światło 50-100Lx

- inicjacja wzrostu i organogeneza - światło 1000-3000Lx

- adaptacja roślin do szklarni - światła 3000-10000Lx

2. widmo światła

* światło niebieskie i bliski ultrafiolet (430-470nm)

- inicjacja różnicowania się pędów

- nadmiar ultrafioletu rozkłada kwasy nukleinowe

* światło czerwone (660nm)

- aktywuje cytokininy i tworzenie się nowych pędów

* daleka czerwień (740nm)

- sprzyja ukorzenianiu się pędów

W praktyce - lampy fluorescencyjne (od White, Flora) TLD 33 - światło białe, TLD 54 - światło dzienne

3. Fotoperiod:

- kultury kalusa ciemność 24h

- organogeneza - światło 12-16h

- organogeneza zbóż - światło 9-11h

- protokormy storczyków - światło 24h

4. temperatura

- zarodki jęczmienia -18^oC - ciemność 24h, 20-22^oC - światło 16h

- izobaty roślin cebulowych - 12-15 ^oC - 3 miesiące, 5 ^oC- 6 tyg

- eksplantaty begonii 18-21 ^oC

- merystemy truskawek 25 ^oC

- drzewa cytrusowe 25-30 ^oC

METODY ROZMNAŻANIA WEGETATYWNEGO IN VITRO

Mikrorozmnażanie

Sposoby rozmnażania roślin ogrodniczych:

1. pobudzanie do rozwoju pąków bocznych - wydajność 2-20 pąków bocznych

2. formowanie pąków bocznych bezpośrednio

3. formowanie paków przybyszowych pośrednio przez kalus

4. embriogeneza somatyczna

Kultura pędów bocznych (pachwinowych)

Metoda stosowana dla rozmnażania niektórych roślin ogrodowych:

• gerbera, spathiphyllus, nephrolepis, orchidaeae

• fragaria ananas, malus domestica

KULTURA PĄKÓW PRZYBYSZOWYCH

Pąki przybyszowe mogą być tworzone na różnych organach roślin - korzeniach, łodygach i liściach.

Metoda stosowana dla roślin:

- cebulowych (liliace, irydaceae, amarylidaceae)

- gesneriaceae (aeschylnanthus, episcira)

- begoniaceae (begonia)

Etapy organogenezy pąków przybyszowych:

- indukcja

- formowanie pąków pędowych

- rozwój pędów

- ukorzenianie

Różnicowanie pąków przybyszowych:

1. bezpośrednie formowanie pąków przybyszowych

2. inicjacja kalusa

3. kultury płynne

EMBRIOGENEZA SOMATYCZNA

Zarodki somatyczne:

1. formują się in vitro z komórek wegetatywnych

2. maja polarną strukturę pęd-korzeń

3. embriogenia może być każda żywa komórka

* najlepsze są eksplantaty izolowane z:

- młodych liści

Hipokotyli i liścieni siewek

Nierozwiniętych pędów kwiatowych

1. Inicjacja kalusa embriogennego:

- auksyna = 2,4D lub Picloron, rzadziej NAN i IAA

- niskie pH pożywki (4,0pH)=1-5nM NH4CL

- kwas salicylowy

- antybiotyki

2. rozwój zarodków (stadia globularne, sercowate i torpedy)

- pożywka pozbawiana auksyn

- dodatek cytokinin

* stymuluje proliferację tkanki embrionalnej i regenerację zarodków

* hamuje jednak potencjał embriogenności w komórkach

3. kiełkowanie zarodków i uzyskanie roślin (konwersja)

- pożywka pozbawiona regulatorów wzrostu

- lub z dodatkiem cytokinin

4. dojrzewanie zarodków

- dodatek kwasu abscysynowego (ABA) - poprawa jakości zarodków

Warunki wewnętrzne w fitotronie

- indukcja - w ciemności lub na świetle czerwonym

- kiełkowanie zarodków rośliny (konwersja) na świetle

Produkcja na skalę komercyjną w USA:

- pseudotsuga meniesi

- pinus taeda

Embriogeneza somatyczna cyklamena:

- wykorzystanie: produkcja materiału siewnego bardzo wysokiej jakości

- wydajność - 40tyś. Sz. Zarodków w 1dm3 pożywki w czasie 10tyg.

Koszty bezpośrednie mikrorozmnażania:

- robocizna 63-85%

- materiały 19%

- amortyzacja 13%

Koszty produkcji roślin in vitro:

- rośliny ozdobne i drzewiaste - koszt metod tradycyjnych

- warzywa = 3-10razy wyższy od metod tradycyjnych

RODZAJE KULTUR STERYLNYCH

Prakultury - zespół zabiegów przygotowujących całe rośliny, ich części lub wyizolowane eksplantaty do wprowadzenia in vitro.

Cele:

1. odmłodzenie eksplantatów

2. uwolnienie od drobnoustrojów

3. termoterapia organów (bulw, kłączy, pędów, nasion) uwalnia od wirusów, bakterii, grzybów, nicieni i owadów.

Dezynfekcja materiału roślinnego:

1. mycie w bieżącej wodzie 60min. - zmywanie bakterii epifitycznych

2. odtłuszczanie powierzchni - 70% etanol w czasie 0,5-30min.

3. odkażanie

- podchloryn sodu Nacl - 0,5%Cl w czasie 30min. (15-90)

- podchloryn wapnia Ca(OCl)2

- chloramina T

- alcie - bakterie

- expor - grzyby

- H2O2

WSPOMAGANIE SEZYNFEKCJI MATERIAŁU ROSLINNEGO

1. technika laserowa

2. ultradźwięki

3. fungicydy

4. antybiotyki -penicylina, siarczan streptomycyny

Kultura kalusa

Kalus= tkanka przyranna

- stale dzieląca się niezorganizowana tkanka

- tkanka o wyglądzie bezpostaciowej masy

- powstaje w naturze w skutek uszkodzenia mechanicznego.

Tkanki z jakich powstaje kalus w naturze:

- kambium (miazga łykodrzewna) np. młode łodygi winogron

- komórki rdzenia np. łodyga niecierpka

Indukcja tworzenia kalusa in vitro

W kulturze in vitro można zainicjować wytworzenie kalusa z dowolnego organu z tkanki poprzez:

- zranienie tkanki

- umieszczenie na pożywce z auksyną

Łatwość tworzenia kalusa zależy od:

- wyboru eksplantatu:

* fragmenty młodych łodyg, korzeni i liści

* fragmenty nasion i zarodków

* kambium waskularne

* protoplasty mezofilu

- fizjologii eksplantatu i jego wieku ontogenicznego (rozwoju osobniczego)

- sezonu pobierania eksplantatu

- wielkości eksplantatu

- lokalizacji w organie (im bliżej pąka szczytowego tym więcej auksyn)

- ogólnej kondycji rośliny - turgor

KULTURY POJEDYNCZYCH KOMÓREK

Cel kultury: otrzymanie klony pojedynczej, wyodrębnionej komórki, który może być użyty do badań morfogenetycznych.

Metody hodowli komórek:

1. na mostku z bibuły filtracyjnej (kwadracik bibuły nasączonej pożywką i metabolitami tkanki tego samego gatunku)

2. w wiszącej kropli (umieszczenie pod szkiełkiem przedmiotowym)

3. w mikrokomorach

4. w szalkach petriego

5. na mikropłytkach - pojemnik z wgłębieniem na dnie

Czynniki decydujące o optymalnym wzroście komórek:

1. równowaga jonów w pożywce

2. warunki osmotyczne środowiska

3. właściwe zbuforowanie pożywki (kwaśne i zasadowe fosforany)

KULTURA ZAWIESIN KOMÓRKOWYCH powstaje z:

1. luźnej, mało zróżnicowanej tkanki kalusowej poddanej dyspersji przez wstrząsanie

2. macerowanych tkanek merystematycznych

3. izolowanych mechanicznie komórek perynchemy

Metody utrzymania zawiesin w ciągłym ruchu:

- wolne obracanie

- wstrząsanie

- wirowanie

- mieszanie

Fazy wzrostu zawiesiny:

1. wzrostu opróżnionego (spoczynkowa) komórki nie dzielą się na świeżej pożywce

2. wzrostu wykładniczego (osiąganie maksymalnej liczby podziałów komórkowych)

3. wzrostu liniowego - komórki silnie rosną

4. stacjonarna - liczba komórek jest stała lub maleje

System hodowli zawiesiny:

1. kultura okresowa - jednorazowe wprowadzenie pożywki do naczynia

2. kultura okresowego dolewania - system półciągły

3. kultura ciągła

- kultura w obiegu zamkniętym - bioreaktory membranowe

- pożywka w obiegu otwartym - ustabilizowana gęstość populacji komórek

KULTURY ORGANÓW

Cel kultury:

1. organogeneza bezpośrednia, stabilna genetycznie

- z merystemów wierzchołkowych, korzenia i pędu

- z merystemów bocznych (kątowych, pachwinowych) łodyg i liści.

KULTURA ODCIĘTYCH KORZENI

Cel:

1. obserwacja rozprzestrzeniania się wirusów w korzeniach

2. pozyskiwanie wtórnych metabolitów roślinnych z kultur ukorzenionych dla celów farmaceutycznych

niezbędne dodatki do pożywki mineralnej:

- auksyny

- sacharoza

- witaminy: B1, B6, PP

KULTURA WIERZCHOŁKÓW I PĄKÓW BOCZNYCH PĘDÓW

Cel:

1. uzyskanie roślin wolnych od wirusów

2. mikrorozmnażanie

3. indukowanie poliploidalności kolchicyną

4. przechowywanie merystemów w ciekłym azocie (-196^OC)

Rodzaje wzrostów

- wydłużony

- rozetowy

KULTURA ODCIĘTYCH LIŚCI

Cel - masowe rozmnażanie roślin

Izolacja:

1. ogonka liściowego

2. nasady blaszki liściowej

3. części środkowej i wierzchołkowej liścia

KULTURY ORGANÓW SPICHRZOWYCH

Cel - masowe rozmnażanie roślin np. narcyzy, tulipany, hiacynty, lilie

Izolacja:

1. fragmentów cebul

2. fragmentów pojedynczych lub podwójnych łusek

3. wycinków bulw lub kłączy

KULTURA ZARODKÓW

Cel:

1. rozmnażanie roślin uzyskanych w wyniku krzyżowania międzygatunkowego

2. przerywanie okresu spoczynku nasion i uzyskanie roślin

FAZY ROZWOJOWE ZARODKÓW

Kultura zarodków niedojrzałych

1. faza heterotroficzna - od fazy zygoty do stadium kulistego (prazarodek)

2. faza autotroficzna - od stadium sercowego

Kultura zarodków dojrzałych

Stadia rozwojowe zarodka: kuliste, sercowate, wczesna torpeda, torpeda, późna torpeda, laska, dojrzałe

Kultura prazarodków - zróżnicowane wymagania odżywcze

KULTURA ZALĄŻKÓW

Cel -łatwiejsze przenoszenie do pożywek:

- całych zalążków zawierających zarodki we wczesnej fazie embriogenezy (storczyki)

- zalążni lub zarodków - fragmenty łożyska

- niezapłodnionych zalążków - ginogeneza, jęczmień, gerbera, cebula.

---