Materiały i sprzęt użyte w doświadczeniu:
- zestaw do izolacji DNA
- liście łubinu wąskolistnego
- ciekły azot
- bufor
- probówki
- pipety automatyczne
- moździerz
- wirówka
- worteks
- termoblok
Przebieg procesu izolacji:
Energiczne ucieranie liści łubinu w moździerzy z dodatkiem ciekłego azotu.
Przeniesienie utartej masy roślinnej do probówki eppendorfa i dodanie buforu PD.
Całość należało wymieszać i inkubować w 50°C przez 30 min.
Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15 sek., a następnie wirować 5 min. przy 10 000 - 14 000 obr./min.
Kolejno przeniesiono do kolumny z filtrem i krótko wirowano.
Dodanie buforu do przefiltrowanego roztworu, a następnie wymieszano pipetą.
Ponowne przeniesienie do kolumny z filtrem i wirowanie.
Filtr, na którym powinno zostać DNA łubinu należy wypłukać i kolejno wirować.
Oznaczenie DNA
Elektroforeza - technika analityczna, rzadziej preparatywna, stosowana w chemii i biologii molekularnej, zwłaszcza w genetyce. Jej istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym.
Elektroforeza na żelu agarozowym:
Do roztworu dodano bromek etydyny, który świeci podczas promieniowania UV.
Nałożenie buforu do pojemników z żelem agarowym
Do próbek w żelu agarowym nakłada się roztwór z DNA
Elektroforeza trwała 1 godzinę.
Odczytanie wyniku za pomocą lampy UV.
Wnioski: Ilość DNA była duża, ale kreska była niewyraźna. Oznaczało to, że DNA jest silnie pofragmentowane.
Pomiar spektrofotometrem:
Za pomocą pipety pobrano roztwór DNA wcześniej rozcieńczony kilkukrotnie wodą.
Wyniki:
Ilość DNA: 58,4 ng/μL
Czystość: 0,93 (czystość= λ260nm/λ280nm)
Wnioski: Optymalna czystość DNA wynosi 1,8. Czystość mniejsza od tej wartości oznacza, że wyizolowane DNA jest zanieczyszczone białkami.
Reakcja PCR
Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (Polymerase Chain Reaction) - metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na reakcji łańcuchowej polimerazy DNA w wyniku wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki
Amplifikacja DNA przy użyciu starterów F i R. Przedmiotem doświadczenia były liście łubinu wąskolistnego.
Skład mieszaniny reakcyjnej:
Lp. |
Odczynnik |
Objętość na próbkę [μL] |
Objętość na grupę (9 os.) [μL] |
1. |
Woda destylowana |
16,5 |
148,5 |
2. |
10 x Bufot Taq |
2,5 |
22,5 |
3. |
MgCl2 |
2,5 |
22,5 |
4. |
dNTP |
0,5 |
4,5 |
5. |
Starter F |
0,5 |
4,5 |
6. |
Starter R |
0,5 |
4,5 |
7. |
Polimeraza Taq |
0,3 |
2,7 |
Dodanie matrycowego DNA łubinu - 2μL
Ustawienie termocyklera:
- wstępna denaturacja - 95˚C przez 5 min.,
- ilość cykli: 35 (denaturacja - w 95˚C przez 30 sek., aniling - 62˚C przez 30 sek., amplifikacja - 72˚C przez 45 sek.),
- końcowa amplifikacja - 72˚C przez 7 min.
Elektroforeza uzyskanego produktu
Do nowej probówki dodano 10μL oraz 3μL buforu.
Całość naniesiono na żel agarozowy w obecności markera DNA.
Elektroforezę prowadzono przez około 30 min. przy napięciu 100V.
Wnioski
Zdjęcie elektroforezy pokazało częściowy sukces, ponieważ część analizowanych próbek posiadała mało widoczne prążki, co świadczy o niskiej amplifikacji. Powodem może być złe przygotowanie produktu lub niewłaściwie dobrana temperatura. Część próbek była widoczna (prążki świeciły się), świadczy to o tym, że reakcja PCR powiodła się.