Materiały i sprzęt użyte w doświadczeniu, Studia, Ogrodnictwo, Biologia molekularna, Materiały różne


Materiały i sprzęt użyte w doświadczeniu:

- zestaw do izolacji DNA

- liście łubinu wąskolistnego

- ciekły azot

- bufor

- probówki

- pipety automatyczne

- moździerz

- wirówka

- worteks

- termoblok

Przebieg procesu izolacji:

  1. Energiczne ucieranie liści łubinu w moździerzy z dodatkiem ciekłego azotu.

  2. Przeniesienie utartej masy roślinnej do probówki eppendorfa i dodanie buforu PD.

  3. Całość należało wymieszać i inkubować w 50°C przez 30 min.

  4. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15 sek., a następnie wirować 5 min. przy 10 000 - 14 000 obr./min.

  5. Kolejno przeniesiono do kolumny z filtrem i krótko wirowano.

  6. Dodanie buforu do przefiltrowanego roztworu, a następnie wymieszano pipetą.

  7. Ponowne przeniesienie do kolumny z filtrem i wirowanie.

  8. Filtr, na którym powinno zostać DNA łubinu należy wypłukać i kolejno wirować.

Oznaczenie DNA

Elektroforeza - technika analityczna, rzadziej preparatywna, stosowana w chemii i biologii molekularnej, zwłaszcza w genetyce. Jej istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym.

  1. Elektroforeza na żelu agarozowym:

  1. Do roztworu dodano bromek etydyny, który świeci podczas promieniowania UV.

  2. Nałożenie buforu do pojemników z żelem agarowym

  3. Do próbek w żelu agarowym nakłada się roztwór z DNA

  4. Elektroforeza trwała 1 godzinę.

  5. Odczytanie wyniku za pomocą lampy UV.

Wnioski: Ilość DNA była duża, ale kreska była niewyraźna. Oznaczało to, że DNA jest silnie pofragmentowane.

  1. Pomiar spektrofotometrem:

  1. Za pomocą pipety pobrano roztwór DNA wcześniej rozcieńczony kilkukrotnie wodą.

Wyniki:

Ilość DNA: 58,4 ng/μL

Czystość: 0,93 (czystość= λ260nm/λ280nm)

Wnioski: Optymalna czystość DNA wynosi 1,8. Czystość mniejsza od tej wartości oznacza, że wyizolowane DNA jest zanieczyszczone białkami.

Reakcja PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (Polymerase Chain Reaction) - metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na reakcji łańcuchowej polimerazy DNA w wyniku wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki

Amplifikacja DNA przy użyciu starterów F i R. Przedmiotem doświadczenia były liście łubinu wąskolistnego.

  1. Skład mieszaniny reakcyjnej:

Lp.

Odczynnik

Objętość na próbkę

[μL]

Objętość na grupę (9 os.)

[μL]

1.

Woda destylowana

16,5

148,5

2.

10 x Bufot Taq

2,5

22,5

3.

MgCl2

2,5

22,5

4.

dNTP

0,5

4,5

5.

Starter F

0,5

4,5

6.

Starter R

0,5

4,5

7.

Polimeraza Taq

0,3

2,7

  1. Dodanie matrycowego DNA łubinu - 2μL

  2. Ustawienie termocyklera:

- wstępna denaturacja - 95˚C przez 5 min.,

- ilość cykli: 35 (denaturacja - w 95˚C przez 30 sek., aniling - 62˚C przez 30 sek., amplifikacja - 72˚C przez 45 sek.),

- końcowa amplifikacja - 72˚C przez 7 min.

  1. Elektroforeza uzyskanego produktu

  1. Do nowej probówki dodano 10μL oraz 3μL buforu.

  2. Całość naniesiono na żel agarozowy w obecności markera DNA.

  3. Elektroforezę prowadzono przez około 30 min. przy napięciu 100V.

Wnioski

Zdjęcie elektroforezy pokazało częściowy sukces, ponieważ część analizowanych próbek posiadała mało widoczne prążki, co świadczy o niskiej amplifikacji. Powodem może być złe przygotowanie produktu lub niewłaściwie dobrana temperatura. Część próbek była widoczna (prążki świeciły się), świadczy to o tym, że reakcja PCR powiodła się.



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Chromatografia podzialowa, Studia, Biochemia i biologia molekularna
Izolacja całkowitego RNA - KONSPEKT, studia - biotechnologia, biologia molekularna
konspekt WESTERN BLOT, studia - biotechnologia, biologia molekularna
konspekt ELEKTROFOREZA SDS-PAGE, studia - biotechnologia, biologia molekularna
AASAES, Studia, Biochemia i biologia molekularna
BIOLOGIA MOLEKULARNA W.14, Różne Spr(1)(4)
BIOLOGIA MOLEKULARNA W.12, Różne Spr(1)(4)
biologia molekularnaa, Studia, V rok, V rok, IX semestr, Biologia molekularna
Regulacja białka supresorowego nowotworów p53. Biologia molekularna. Seminarium 1, biologia- studia
materiały na 14 zajęcia, studia PWr, biologia, biologia (1), biologia
Operon, Studia, V rok, V rok, IX semestr, Biologia molekularna
różnice między eubacteria i eucarya, Studia, V rok, V rok, IX semestr, Biologia molekularna
Biologia molekularna- egz.2004, Studia Farmacja, Giełdy 2 rok, biologia molekularna
Zagadnienia na ćwiczenia z Biologii molekularnejFarm2009, Studia i edukacja, farmacja
Biologia Molekularna - kolokwium(1), biologia- studia
najpier wjest wzorcowy, Studia UMCS, IV semestr, Biologia molekularna
Skrypt-BiologiaMolekularna, Studia UMCS, IV semestr, Biologia molekularna

więcej podobnych podstron