Materiały i sprzęt użyte w doświadczeniu:

- zestaw do izolacji DNA

- liście łubinu wąskolistnego

- ciekły azot

- bufor

- probówki

- pipety automatyczne

- moździerz

- wirówka

- worteks

- termoblok

Przebieg procesu izolacji:

1. Energiczne ucieranie liści łubinu w moździerzy z dodatkiem ciekłego azotu.

2. Przeniesienie utartej masy roślinnej do probówki eppendorfa i dodanie buforu PD.

3. Całość należało wymieszać i inkubować w 50°C przez 30 min.

4. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15 sek., a następnie wirować 5 min. przy 10 000 - 14 000 obr./min.

5. Kolejno przeniesiono do kolumny z filtrem i krótko wirowano.

6. Dodanie buforu do przefiltrowanego roztworu, a następnie wymieszano pipetą.

7. Ponowne przeniesienie do kolumny z filtrem i wirowanie.

8. Filtr, na którym powinno zostać DNA łubinu należy wypłukać i kolejno wirować.

Oznaczenie DNA

Elektroforeza - technika analityczna, rzadziej preparatywna, stosowana w chemii i biologii molekularnej, zwłaszcza w genetyce. Jej istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym.

1. Elektroforeza na żelu agarozowym:

1. Do roztworu dodano bromek etydyny, który świeci podczas promieniowania UV.

2. Nałożenie buforu do pojemników z żelem agarowym

3. Do próbek w żelu agarowym nakłada się roztwór z DNA

4. Elektroforeza trwała 1 godzinę.

5. Odczytanie wyniku za pomocą lampy UV.

Wnioski: Ilość DNA była duża, ale kreska była niewyraźna. Oznaczało to, że DNA jest silnie pofragmentowane.

2. Pomiar spektrofotometrem:

1. Za pomocą pipety pobrano roztwór DNA wcześniej rozcieńczony kilkukrotnie wodą.

Wyniki:

Ilość DNA: 58,4 ng/μL

Czystość: 0,93 (czystość= λ260nm/λ280nm)

Wnioski: Optymalna czystość DNA wynosi 1,8. Czystość mniejsza od tej wartości oznacza, że wyizolowane DNA jest zanieczyszczone białkami.

Reakcja PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (Polymerase Chain Reaction) - metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na reakcji łańcuchowej polimerazy DNA w wyniku wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki

Amplifikacja DNA przy użyciu starterów F i R. Przedmiotem doświadczenia były liście łubinu wąskolistnego.

1. Skład mieszaniny reakcyjnej:

Lp.	Odczynnik	Objętość na próbkę [μL]	Objętość na grupę (9 os.) [μL]
1.	Woda destylowana	16,5	148,5
2.	10 x Bufot Taq	2,5	22,5
3.	MgCl2	2,5	22,5
4.	dNTP	0,5	4,5
5.	Starter F	0,5	4,5
6.	Starter R	0,5	4,5
7.	Polimeraza Taq	0,3	2,7

2. Dodanie matrycowego DNA łubinu - 2μL

3. Ustawienie termocyklera:

- wstępna denaturacja - 95˚C przez 5 min.,

- ilość cykli: 35 (denaturacja - w 95˚C przez 30 sek., aniling - 62˚C przez 30 sek., amplifikacja - 72˚C przez 45 sek.),

- końcowa amplifikacja - 72˚C przez 7 min.

4. Elektroforeza uzyskanego produktu

1. Do nowej probówki dodano 10μL oraz 3μL buforu.

2. Całość naniesiono na żel agarozowy w obecności markera DNA.

3. Elektroforezę prowadzono przez około 30 min. przy napięciu 100V.

Wnioski

Zdjęcie elektroforezy pokazało częściowy sukces, ponieważ część analizowanych próbek posiadała mało widoczne prążki, co świadczy o niskiej amplifikacji. Powodem może być złe przygotowanie produktu lub niewłaściwie dobrana temperatura. Część próbek była widoczna (prążki świeciły się), świadczy to o tym, że reakcja PCR powiodła się.

---