Temat: Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

Zagadnienia:

• Metody rozdzielania, identyfikacji i oczyszczania fragmentów DNA

• Parametry szybkości elektroforetycznej migracji DNA w żelu agarozowym

Rozdział elektroforetyczny kwasów nukleinowych umożliwia:

• Ustalenie wielkości fragmentów DNA lub cząsteczek RNA na podstawie porównania tempa migracji badanych prążków w stosunku do wzorca mas cząsteczkowych. Wzorcem jest preparat zawierający fragmenty DNA o znanych wielkościach.

• Ustalenie ilość preparatu na podstawie porównania intensywność fluorescencji badanego prążka do preparatu DNA wzorcowego.

• Identyfikację ewentualnej degradacji preparatu. Degradacja widoczna jest na żelu w postaci smugi, które jest wynikiem rozpadu DNA lub RNA na mniejszej fragmenty.

• Identyfikację zanieczyszczeń obecnych w preparacie. Białka towarzyszące kwasom nukleinowym widoczne są w postaci kompleksów DNA/białko zalegających w kieszonkach. Natomiast RNA zanieczyszczający preparaty DNA widoczny jest w postaci smugi migrującej przed błękitem bromofenolowym.

Procedura

1. Do szklanej kolby stożkowej albo okrągłodennej (250-500 ml) odważyć ilość agarozy stosowaną do potrzebnego stężenia i objętości tacki do wylewania żelu. Należy odważyć 1g agarozy do przygotowania 100 ml 1 % żelu.

2. Wlać do kolbki wymaganą objętość buforu do elektroforezy (1xTBE).

3. Zamieszać silnie zawartość kolbki i rozpuścić agarozę przez zagotowanie. Najwygodniej jest użyć do tego celu kuchenki mikrofalowej, ale żel można również ogrzewać przy pomocy zwykłego palnika laboratoryjnego lub płaszcza grzejnego. Jeśli agaroza nie jest całkowicie rozpuszczona należy powtórzyć gotowanie.

UWAGA!

Upłynniony i rozgrzany żel agarozowy silnie kipi - oparzenia mogą być bardzo dotkliwe.

d) Schłodzić żel w temperaturze pokojowej do temperatury około 60^oC.

e) Do schłodzonego żelu dodać roztworu bromku etydyny do stężenia 0,1 μg/ml i silnie

zamieszać.

UWAGA!

Bromek etydyny jest silnym kancerogenem. Unikać kontaktu ze skórą, przy pracy z

bromkiem etydyny używać rękawic gumowych.

6. Wylać żel na wcześniej przygotowaną i umieszczoną w lodówce tackę. Niezwłocznie umieścić grzebień w żelu. W żelu nie powinno być żadnych pęcherzyków powietrza.

7. Po zastygnięciu żelu (około 20 minut) ostrożnie wyjąć grzebień, umieścić tackę z żelem w naczyniu do elektroforezy i zalać żel buforem (1xTBE), tak aby żel był 2-3 mm pod powierzchnią buforu.

8. Próbki i wzorce masowe DNA zmieszać z odpowiednią ilością buforu obciążającego z barwnikiem i nanieść na żel.

9. Rozwijać elektroforezę do uzyskania odpowiedniego rozdziału przy napięciu 90V.

10. Obejrzeć żel na transiluminatorze UV, w przypadku niedostatecznego rozdziału można kontynuować elektroforezę. Wykonać dokumentację żelu. Narysować w zeszycie żel, układ prążków i wypisać wnioski.

1

---