GENETYKA i SPOŁECZEŃSTWO

POZNANIE GENOMU CZŁOWIEKA - Przed przystąpieniem do realizacji projektu sekwencjonowania genomu człowieka konieczne jest opracowanie dokładnych map genetycznych. Można to zrobić przez fizyczne lub genetyczne mapowanie genomu. Przy konstruowaniu map genetycznych ważne jest dysponowanie dużą liczbą polimorficznych markerów. Początkowo stosowano polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), który zastąpiono badaniami zmiennej liczby tandemowych powtórzeń (VNTR). Obecnie dostępne są liczne metody analizy polimorfizmu pojedynczych nukleotydów.

Mapy genetyczne - Mapy genetyczne są oparte na częstościach rekombinacji między markerami. Wskaźnik LoD - logarytm nierówności sprzężeń -zastosowano do oznaczenia najbardziej prawdopodobnej częstości rekombinacji pomiędzy markerami. Ponieważ częstość rekombinacji nie jest stała w obrębie całego genomu, mapy genetyczne są przydatne do ustalenia kolejności genów, lecz nie dają dokładnej informacji o odległościach fizycznych między markerami. Najdokładniejsze mapy genetyczne zawierają dane o ponad pięciu tysiącach markerów mikrosatelitarnych.

Mapy fizyczne - Tworzenie map fizycznych rozpoczęto od podziału genomu na mniejsze fragmenty. Następnie w każdym z nich określono lokalizację genów lub markerów DNA. Do ustalenia położenia genów w regionach chromosmowych wykorzystano hybrydowe komórki somatyczne tworzone pomiędzy komórkami człowieka i gryzoni. Rozwój tej metody, prowadzący do otrzymania hybrydów radiacyjnych, umożliwił opracowanie map genomowych, przedstawiających dokładne odległości między markerami. Takie mapy można także tworzyć przez klonowanie genomowego DNA ludzkiego w odpowiednich wektorach. Grupy klonowanych fragmentów DNA (kontigi) układa się w szeregi, tak aby sekwencje częściowo się pokrywały. Następnie sekwencje te są lokalizowane na mapach ogólnych za pomocą markerów typu STS (ang. sequence tagged sites), zawierających sekwencje komplementarne do określonych miejsc w genomie.

Analiza sekwencyjna - W celu określenia sekwencji dużych fragmentów DNA zastosowano dwie metody oparte na klonowaniu w sztucznym chromosomie bakteryjnym (BAC). W pierwszej z metod do tworzenia map BAC-ów w kontigach użyto „genetyczny odcisk palca". BAC-i sekwencjonowano, a następnie znane sekwencje łączono razem wykorzystując mapy w kontigach. Metoda alternatywna polegała na sekwencjonowaniu wpierw BAC-ów, a następnie łączenia ich sekwencji aż do otrzymania pełnej sekwencji całego chromosomu. W tym przypadku pojawiły się pewne problemy związane z obecnością powtarzających się sekwencji. Obie metody okazały się przydatne do tworzenia zarysów sekwencji ludzkiego DNA.

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ - Hybrydyzowanie preparatów chromosomów człowieka z sondami DNA pozwala na bezpośrednie mapowanie genów i określenie ich lokalizacji na chromosomach. Sondy są znakowane fluorochromem lub można je wykrywać metodami immunofluorescencyjnymi.

Lokalizacja genów na mapie - Geny można lokalizować na mapach ogólnych badając rodowody osób dotkniętych chorobą. Kiedy na mapie zlokalizuje się pozycję genu predysponowanego do określonego zaburzenia dziedziczonego inne znane geny zlokalizowane w tym regionie określa się jako geny kandydaci. Odpowiedzialny za chorobę gen można następnie badać analizując mutacje u osób dotkniętych chorobą oraz jej nosicieli. Klonowanie takich genów nazywamy klonowaniem pozycyjnym. Znane sekwencje cDNA mogą być mapowane bezpośrednio z wykorzystaniem hybryd radiacyjnych lub na kontigach. Metodą alternatywną jest wykorzystanie sekwencji cDNA do przeszukiwania sekwencji ludzkiego DNA w bankach baz danych. Podobnie można postępować z anonimowym DNA. Określa się to jako etykietki sekwencji ulegających ekspresji (EST). Do identyfikacji nowego genu i badania sekwencji charakterystycznej dla genu struktury można zastosować bezpośrednią analizę DNA. Odkrywanie genów jest procesem poszukiwania nowych członków określonych rodzin genów.

Podsumowanie - Ostateczne wyniki z sekwencjonowania genomu ludzkiego nie są pełne. Szczególny problem stwarzają te regiony w genomie, które trudno się klonuje, oraz zawierające sekwencje powtarzające się. Nie zawsze wyniki sekwencjonowania są dokładne, dlatego w celu otrzymania prawidłowej sekwencji każda z zasad musi być poddana kilkakrotnemu sekwencjonowaniu, w celu zredukowania błędu poniżej 0,01%. Ostateczne wyniki z sekwencjonowania genomu człowieka mają ważne znaczenie dla nauk medycznych i biologicznych.

GENETYKA W SĄDOWNICTWIE

Unikatowe korelacje - Organizmy rozmnażające się płciowo są niepowtarzalne. Wszystkie komórki danego osobnika zawierają taką samą informację genetyczną, dlatego materiał genetyczny
o nieznanym pochodzeniu może być porównywany z próbami pobranymi od określonych osób. Istotna wartość techniki opartej na analizie genetycznej polega na dostarczaniu dowodów wykluczających przypuszczenia. Pojedyncze różnice między obrazem analizy próby pobranej z miejsca zbrodni i od podejrzanego mogą wykazać brak powiązań i uwolnić od podejrzeń osobę niewinną. W razie uzyskania identycznych obrazów można jeszcze dla pewności obliczyć prawdopodobieństwo przypadkowego znalezienia takiego samego genotypu w populacji, pod warunkiem jednak, że częstość występowania badanych alleli w tej populacji jest znana. Genetyczna analiza pokrewieństwa może być pomocna do ustalania powiązań rodzinnych, a także w odnalezieniu naturalnych rodziców. Techniki te można stosować nie tylko w odniesieniu do człowieka, ale również w takich przypadkach jak np. poszukiwanie zagubionych, czy skradzionych koni lub jastrzębi. Stosując łańcuchową reakcję polimeryzacji (PCR) można z niewielu komórek otrzymać genetyczne profile, które często pozwalają na ustalenie niewątpliwej genetyczne tożsamości.

Badania porównawcze białek - Białka mogą być porównywane technikami immunologicznymi (np. wykorzystując przeciwciała do określenia grupy krwi czy typu tkanki) lub elektroforetycznie dzięki różnicom stosunku ładunku do masy, spowodowanym substytucjami aminokwasów. Korzystając z tych technik można z danej populacji wykluczyć większość przypadków.

Badania porównawcze DNA - Wszystkie komórki jednego organizmu zawierają kopie tej samej sekwencji DNA. Wśród organizmów rozmnażających się płciowo każdy osobnik ma unikatową sekwencję DNA. Jeśli porównując (dostatecznie szczegółowo) sekwencje DNA z próbki tkanki znalezionej na miejscu przestępstwa z sekwencją DNA podejrzane cc zaobserwuje się różnice, to wskazują one na brak powiązań podejrzanego (albo jego lub jej klonu) z tym przestępstwem. Do celów sądowniczych wykorzystuje się zmienne sekwencje mikro -i minisatelitarne, są to jednostki zawierające od 3-4 par zasad, powtórzone 10-20 razy. Szeregi te często w wyniku mutacji zmieniają swoją długość (liczbę powtórzeń), stąd ich nazwa — zmienna liczba tandemowych powtórzeń (VNTR). Zmienność tę po raz pierwszy zidentyfikowano analizując polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Gdy dwie próby są identyczne, wówczas wszystkie fragmenty między sąsiednimi miejscami restrykcyjnymi mają taką samą długość. Tego typu badania zostały wyparte przez techniki wykorzystujące PCR.

RFLP - genetyczny odcisk palca - RFLP występuje wówczas, gdy odległość między kolejnymi miejscami restrykcyjnymi została zmieniona przez mutację. Metoda genetycznego „odcisku palca" polega na pocięciu genomowego DNA enzymem restrykcyjnym, elektroforetycznym rozdziale uzyskanych fragmentów i hybrydyzacji metodą Southerna, z zastosowaniem sondy dla wielu loci. Technika ta pozwala na wykrycie powtarzających się sekwencji, które występują w licznych miejscach genomu, i w efekcie uwidacznia wiele prążków w unikatowej kombinacji. Jej mankamentem jest potrzeba stosunkowo dużej ilości DNA oraz mnogość wyników trudnych do ilościowej oceny i przedstawienia w sądzie.

VNTR - profile genetyczne - Standardową techniką stosowaną do powielania DNA pojedynczego VNTR jest PCR, z użyciem specyficznej pary starterów. Pozwala ona na identyfikację poszczególnych alleli i określenie liczby powtórzeń VNTR w każdym z nich. Częstość występowania każdego
z alleli w populacji można oznaczyć wykorzystując do ilościowego opracowania wyników wszystkie tradycyjne techniki genetyki populacyjnej. Jeśli stosuje się sondy dla dostatecznej ilości loci w allelach rzadko występujących, prawdopodobieństwo otrzymania takich samych obrazów fragmentów DNA jest nieskończenie male. Metodą PCR-multiplex można uzyskać dobre wyniki używając sond dla czterech loci w DNA wyizolowanym ze śliny lub z kilku komórek pochodzących z cebulek włosów.

Interpretacja wyników - Wykrycie pojedynczej różnicy w obrazach dwu analizowanych prób jest dowodem ich różnego pochodzenia. Jeżeli obrazy są identyczne, wówczas należy określić prawdopodobieństwo przypadkowego pojawienia się dwóch identycznych prób w populacji. Jednakże w przypadku genetycznego „odcisku palca" nie jest to proste, ponieważ dokładne określenie pozycji poszczególnych prążków jest trudne, w praktyce dwie próby zawsze dają różne obrazy, a więc łatwo można podważyć podstawowe założenia metody. Analiza VNTR pozwala na klasyfikację każdego z alleli na podstawie liczby powtórzeń w satelitarnym DNA. Częstość występowania każdego z alleli w populacji można oznaczyć, a także dokładnie obliczyć prawdopodobieństwo wystąpienia przypadkowej genetycznej identyczności dla dwóch prób, pochodzących od różnych osób. Przyjmuje się, że istnieje pewien stopień wsobności, dlatego obliczenia są prowadzone w sposób przesadnie ograniczający możliwość popełnienia błędu.

BIOTECHNOLOGIA

Inżynieria biochemiczna i biotechnologiczna - dziedziny te obejmują badania naukowe związane z technikami przenoszenia genów w celu uzyskania zrekombinowanych białek i genetycznie zmodyfikowanych organizmów. Wykorzystanie praktyczne tych technik doprowadziło do rozwoju przemysłu biotechnologicznego.

Ekspresja białek zrekombinowanych - w komórce gospodarza wektory ekspresyjne kierują transkrypcją i translacją klonowanego DNA, co prowadzi do powstania zrekombinowanego białka. Ekspresja genów kodujących białka musi być każdorazowo optymalizowana. Techniki inżynierii białek umożliwiają wytwarzanie różnych wariantów natywnego białka o zmienionych właściwościach.

Bakteryjne systemy ekspresyjne - Do ekspresji obcych genów kodujących białka najpowszechniej wykorzystywane są bakterie E. coli. Najważniejsze cechy bakteryjnego wektora ekspresyjnego to obecność silnego promotora, sygnały terminacji transkrypcji, miejsce wiązania rybosomu, kodony start i stop odpowiednio na początku i końcu otwartej ramki odczytu oraz mechanizm indukcji ekspresji. Białka poddawane syntezie w systemach bakteryjnych zabezpiecza się przed degradacją poprzez umieszczenie dodatkowych aminokwasów na końcu N białka. Poziom ekspresji można zwiększyć stosując plazmidy występujące w komórce w dużej liczbie kopii. Istnieje jednak niebezpieczeństwo, że w tej sytuacji plazmidy mogą być niestabilne. Wektory, które integrują z genomem gospodarza, są stabilne, jednak poziom uzyskiwanej ekspresji jest niższy.

Eukariotyczne systemy ekspresyjne - Białka uzyskiwane na drodze ekspresji odpowiednich genów w systemach eukariotycznych są modyfikowane potranslacyjnie, co zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania biologicznie aktywnego produktu. Eukariotyczne wektory ekspresyjne są projektowane podobnie jak wektory prokariotyczne. Wiele z nich jest wektorami czółenkowymi (wahadłowymi), to znaczy, że mogą powielać się również w komórkach bakteryjnych. Jako komórki gospodarze do ekspresji w systemach eukariotycznych stosuje się komórki drożdży, owadów i ssaków. Drożdże są łatwym obiektem pracy. Ich komórki mogą być transfekowane obcym DNA jako protoplasty, lub poprzez elektroporację. Wektory drożdżowe mogą być episomalne lub integracyjne. Bakulowirusy infekują komórki owadów. Genomy tych wirusów można przystosować do spełniania funkcji wektorów ekspresyjnych, w których transkrypcja klonowanego genu odbywa się pod silnym promotorem poliedryny. Uzyskiwane białka ulegają glikozylacji, a jej przebieg bardzo przypomina glikozylację ssaczych białek. Ekspresję w komórkach ssaków wykorzystuje się w celu uzyskania zrekombinowanych białek identycznych z białkami natywnymi. Takie białka mogą być wykorzystywane jako leki.

Przeciwciała monoklonalne - U zwierząt występują miliony limfocytów klonalnych. Każdy z klonów jest zdolny do syntezy tylko jednego rodzaju przeciwciała. W odpowiedzi na infekcję bakteriami, którą można postrzegać jako wtargnięcie do organizmu złożonego antygenu, zawierającego wiele epitopów (na powierzchni komórek bakteryjnych), stymulacji ulega bardzo duża liczba limfocytów klonalnych produkujących przeciwciała. Są to przeciwciała poliklonalne. Jeśli dokonać fuzji pojedynczego limfocytu z komórką szpiczaka, a następnie pozwolić rosnąć tym „unieśmiertelnionym" hybrydom w hodowli tkankowej, to będą one produkować monoklonalne przeciwciała.

TRANSGENIKA

Rośliny modyfikowane genetycznie - transfer genów wykorzystuje się do tworzenia roślin o zmienionych właściwościach. Plazmid Ti Agrobacterium tumefaciens powoduje powstawanie guzowatości u roślin. Zdolność integracji regionu T DNA plazmidu Ti do chromosomów roślinnych umożliwił użycie go jako wektora genetycznego w celu przenoszenia do roślin obcych genów. Alternatywne metody transferu genów polegają na mikrobombardowaniu komórek roślinnych metalowymi kulkami opłaszczonymi DNA. Modyfikacja genetyczna umożliwia stworzenie roślin odpornych na owady, infekcję wirusową i działanie herbicydów. Rośliny potencjalnie mogą być wykorzystane jako bioreaktory do produkcji zrekombinowanych białek.

Zwierzęta transgeniczne - Transfer genów może być wykorzystany do uzyskiwania zwierząt o nowych korzystnych cechach. Transgeny są wprowadzane do zapłodnionej komórki jajowej lub komórek embrionu we wczesnym stadium rozwoju za pomocą metody mikroiniekcji, poprzez modyfikację embrionalnych komórek macierzystych lub przy użyciu wektorów retrowirusowych. Zmodyfikowane embriony wprowadzane są do macicy osobnika, u którego nastąpi dalszy rozwój zarodka. Zwierzęta transgeniczne są wykorzystywane jako obiekty badawcze służące zarówno do analizy funkcji genów, jak i do konstruowania zwierzęcych modeli chorób ludzkich. Transgeniczne owce i kozy są wykorzystywane do produkcji zrekombinowanych białek wydzielanych z mlekiem.

Klonowanie zwierząt - Pierwszymi sklonowanymi zwierzętami były płazy. Jądra zwierząt i z dojrzałych komórek przeniesiono do niezapłodnionych jaj, z których jądra komórkowe zostały usunięte. Część osobników, przygotowanych w ten sposób, przeżywała osiągając okres dojrzałości. Embriony ssaków we wczesnej fazie rozwoju mogą być podzielone i wprowadzone do matek zastępczych. W ostatnich latach technika przenoszenia jąder komórkowych została zastosowana u kilku gatunków ssaków. Tylko nieliczna część klonowanych w ten sposób komórek jajowych rozwijała się do osiągnięcia etapu narodzin osobnika. U sklonowanych osobników często obserwuje się występowanie efektów ubocznych, takich jak: otyłość, skrócony okres przeżycia, częsta zachorowalność na raka. Osobniki sklonowane mogą dziedziczyć zmiany, które zaszły w komórce donorowej przed pobraniem jądra. Klonowanie dojrzałych komórek może być źródłem komórek macierzystych wykorzystywanych do leczenia chorób.

Etyka - wiedza genetyczna i nowe dostępne techniki stwarzają obecnie możliwości, które były kiedyś niemożliwe do realizacji. Obejmują one od procedur, które są niewątpliwie korzystne, do horrorów z rodzaju science fiction, z całym spektrum pośrednim. Moralne decyzje wymagają od poszczególnych osób i społeczeństw wytyczenia linii i określenia, co jest dobre, co złe, co dozwolone, a co nie. Tego typu decyzje są arbitralne i opierają się na zestawieniu korzyści i stron ujemnych, a także muszą uwzględniać aspekty religijne i kulturowe (np. kara śmierci za morderstwo). Nie nakreślamy tej linii, ale stawiamy kwestie i argumenty za i przeciw, abyś zadecydował, co jest dozwolone, a co nie, i najważniejsze, dlaczego podjąłeś taką, a nie inną decyzję.

Prawo do prywatności i korzyści - Wzrastająca dostępność informacji o genotypach poszczególnych osobników rodzi pytanie o prywatność (kto mógłby wiedzieć) i kto miałby osiągnąć korzyść z tej wiedzy. Czy towarzystwa ubezpieczeniowe miałyby prawo do informacji o ryzyku genetycznym swoich klientów. Ludzie posiadający wiedzę o wysokim ryzyku własnej śmierci lub choroby mogliby ubezpieczać się wysoko i uzyskiwać wysokie premie. Ludzie o niskim ryzyku woleliby płacić niższe składki ubezpieczeniowe. Towarzystwa ubezpieczeniowe różnicowałyby składki, a ludzie o wysokim ryzyku mogliby nie mieć szansy na uzyskanie ubezpieczenia w ogóle. Pracodawcy mogliby nie zatrudniać ludzi „słabych" genetycznie, a „pośledni" genetycznie mogliby być napiętnowani przez społeczeństwo. Firmy farmaceutyczne mogłyby wykorzystać dane o sekwencji DNA poszczególnych osób, rodzin czy społeczności do określenia ich genetycznej kondycji w celu produkcji lekarstw
i osiągania dzięki temu wysokich zysków. Czy dostarczyciel takich informacji miałby także osiągać zyski? Czy państwo powinno mieć dane w formie stałych etykiet, niemożliwych do zgubienia lub podrobienia, o profilach genetycznych zdecydowanych kryminalistów lub całej populacji do przewidywania możliwości popełnienia nowych przestępstw lub identyfikowania zaginionych osób i anonimowych zwłok?

Moralne wybory - We wszystkich moralnych decyzjach związanych z genetyką problemem jest, gdzie nakreślić linię interwencji. Przesiewne badania genetyczne identyfikują osoby z dziedzicznymi chorobami genetycznymi. Pozwala to na selektywne przerywanie ciąży o wysokim ryzyku urodzenia dziecka z defektem genetycznym. Podobnie, kiedy znana jest historia chorobowa rodziny, może być zastosowana diagnoza preimplantacyjna po zapłodnieniu in vitro dla pewności, że tylko „zdrowe" embriony będą implantowane w macicy. Niektórzy ludzie ze względów religijnych lub ideologicznych będą odrzucać możliwość przerwania ciąży, jednak większość będzie ją akceptować, jeśli dziecko miałoby się urodzić poważnie upośledzone, że z pewnością umrze po paru dniach po narodzeniu lub po miesiącach cierpień. Większość dyskusji dotyczy sytuacji, kiedy dziecko może się spodziewać kilku lat normalnego lub szczęśliwego życia. Na przykład, czy można interweniować, aby zapobiec urodzinom zdrowego początkowo dziecka w przypadku, kiedy nie ono ma szans osiągnięcia dojrzałości (choroba Taya-Sachsa) lub które będzie miało jedynie nieznaczne fizyczne lub umysłowe upośledzenie (zespół Downa), względnie kiedy objawy choroby mogą być w pełni niwelowane przez odpowiednie leczenie (fenyloketonuria). W krańcowym przypadku, czy można zastosować preimplantacyjną interwencję w celu wyboru płci dziecka, koloru oczu, czy jego zdolności. Tego typu działania istnieją w niektórych społecznościach, gdzie panna młoda musi otrzymać wiano, zatem synowie są preferowani. Wiele milionów (na pokolenie) dzieci płci żeńskiej podlega aborcji, są zabijane bez użycia technik genetycznych, lub porzucone, aby umarły.

Potencjalne szkody - Genetyczna modyfikacja osobników lub populacji niesie hipotetyczne ryzyko. Istnieją obawy przed modyfikacją ludzkiej puli genowej przez rodzenie dzieci o określonych tylko cechach. Tego rodzaju działalność dotyczyłaby bogatych ludzi i miałaby niewielki wpływ na skalę globalną, ale tworzyłaby genetyczną elitę. Inna możliwość to przypadkowe lub umyślne stworzenie śmiertelnego patogena. Manipulacje genetyczne i klonowanie zwierząt i roślin użytkowych ma tutaj bezpośrednie przełożenie. Istnieją szczególne obiekcje, jeżeli chodzi o tworzenie transgenicznych gatunków przez przenoszenie genów z jednego gatunku do drugiego. To fundamentalne zastrzeżenie dotyczy odgrywania przez genetyków roli Boga i zmieniania Jego planu stworzenia. Istnieją tu dwa istotne uwarunkowania: koszt uzyskanych korzyści w stosunku do ryzyka, stosowanej aktualnie praktyki. Dostrzega się tutaj znaczne ryzyko. Zwyczajny akt dodania lub zmiany pojedynczego genu może mieć nieprzewidzialne konsekwencje. Jednak jeśli gen i jego produkt jest dokładnie znany, manipulacja genetyczna jest bezpieczniejsza niż konwencjonalna hodowla, w wyniku której wprowadza się setki nieznanych genów, względnie wywołuje mutacje, a później selekcjonuje pożądany fenotyp bez badania możliwych efektów. Przysparza się cierpień zwierzętom genetycznie modyfikowanym ludzkimi chorobami genetycznymi, np. myszom z mukowiscydozą lub bydłu z przyspieszonym wzrostem mięśni, lub zwiększoną produkcją mleka. Muszą być tu ocenione koszty i korzyści. Istnieją regulacje dotyczące eksperymentów laboratoryjnych ze zwierzętami, ale żadne z nich nie obejmują konwencjonalnej hodowli, w wyniku której uzyskuje się szereg nienormalności
(np. karłowate psy, których oczy mają tendencję do wypadania, krowy z ogromnymi wymionami). Rośliny uprawne wytwarzające pestycydy mogą być także toksyczne dla innych bezbronnych gatunków, lecz alternatywą jest tu użycie chemicznych oprysków, które są generalnie gorsze. Rośliny odporne na pestycydy stwarzają możliwość chemicznego usunięcia chwastów, lecz tym sposobem niszczy się środowisko życia dla innych dziko żyjących stworzeń. Celem rolnictwa jest jednak zastąpienie naturalnych ekosystemów przez uprawy. Ogień i orka mają znacznie większy wpływ na środowisko, a stosowane są przez tysiące lat. Większa wydajność ziemi już uprawianej zmniejsza potrzebę poszerzenia terenów uprawnych (np. o tereny lasów deszczowych) i może to pozwoli słabszym glebom powrócić do stanu naturalnego.

Genetyka semestr VI

---