1. Budowa DNA

1. Czym jest DNA? I z czego jest zbudowane? Jakie są zasady?

2. Jaka jest jego organizacja? Co to jest zasada komplementarności? Które zasady łączą się z którymi? Które to pirymidyny a które puryny?

3. Jaka jest podstawowa organizacja (helisa, chromosom, genom)

4. Wymienić i rozróżnić 2 metody izolacji DNA: fenolowa i chromotografii jonowymiennej.

• Jeżeli normalnej dwuniciowej cząsteczce DNA guanina stanowi 18% wszystkich zasad, to ile procent stanowi adenina?

• Sekwencja jednej z dwóch nici DNA jest następująca: 5'-ATGC-3'

Dopisz nic komplementarną:

• Parowanie nukleotydów podlega specyficznym regułom wypisz je (liniami między literami oznacz liczbę wiązań)

• Jak dużo telomerów ma nie dzieląca się ludzka komórka wątroby?

(P czy F)

1. Czy (A+G)/C+T = 1 ? (P czy F)

2. DNA eukariotycznego chromosomu jest jedną długą podwójna helisą?

3. Niektóre komórki, np. wątroby są przekazywane potomstwu.

4. Centromer jest zawsze umiejscowiony w środku chromosomu

5. Telomer jest zawsze na końcu chromosomu

2. Izolacja DNA

1. Od czego zaczynamy? Pobór tkanek. Włosy, krew, tkanki…

2. Homogenizacja czyli jak się dostać do DNA? W jakim celu? Mechaniczna, bufor lizujący z detergentem który destabilizuje błony, proteinaza K tnie wiązania peptydowe, Czyli do czego służy bufor? Do czego służy proteinaza K?

3. METODA I (fenolowa): Otworzenie komórek - degradacja/usunięcie wszystkich składników poza DNA (wirowanie, wytrącanie białek w fenolu, pocięcie RNA rybonukleazą) - wytrąceni polinukleotydów DNA (etanol) - osadzenie (wirowanie)- rozpuszczenie w buforze

4. METODA II (chromotografi jonowymienna). Wiązanie do kolumny i złoża krzemionkowego naładowanych dodatnio. Jaki ładunek ma DNA? DNA w wysokim stężeniu soli wiąże się do krzemionki. Wymywanie - roztworem o niskim stężeniu soli Jaka jest rola soli? Rozbicie płaszcza wodnego otaczającego DNA, wiązań jonowych. Wymywanie białek i RNA (1,o M NaCl, pH 7,0), wymywanie DNA (1,25M NaCl, pH 8,5). Czyszczenie - bufor z etanolem.

5. Przechowywanie - rola EDTA - chelatuje jony Mg niezbędne do działania DNAz

6. Jak ocenić jakość DNA? Spektrofotometrycznie - pomiar absorbancji przy 260 nm (max absorbancji dla DNA) 260/280 gdy mniejszy < 1.7 zanieczyszczenie białkami; 260/230 gdy mniejszy polisacharydami

3. Plazmidy:

1. Co to są plazmidy

2. Budowa plazmidu: ORI, Amp, LacZ, polilinker?

3. Mapa plazmidu

Na podstawie map restrykcyjnych zaproponuj cięcie plazmidu. Podaj nazwy enzymów, temperaturę cięcia i dezaktywacji. a) Jakiej wielkości fragmenty DNA uzyskasz po cięciu wybranymi enzymami? b) plazmid został pocięty dwoma plazmidami PvuI, EcoRV, każdym z osobna oraz oboma na raz. Jakich wielkości fragmentów można się spodziewać w wyniku takiego cięcia restrykcyjnego.

4. Enzymy restrykcyjne

4. Co to jest? Skąd się je bierze?

5. Jakie sekwencje rozpoznają (palindromiczne), 4, 5, 6 par zasad, które będą ciąć częściej które rzadziej? Co to są lepkie i tępe końce?

6. W jakich warunkach tną enzymy?

7. Możemy ciąć DNA genomowe, plazmidowe lub fragmenty,

Wyizolowałeś cząsteczkę DNA o długości 8 tysięcy par zasad (8 kb). Następnie trawiłeś ją dwoma enzymami restrykcyjnymi: EcoRI oraz HindIII. Otrzymałeś fragmenty o następującej długości (w kb):Narysuj mapę restrykcyjną wyizolowanego fragmentu DNA

EcoRI HindIII EcoRI + HindIII

7 5 4

1 3 3

1

Poniżej przedstawiono sekwencje rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne. Zaznaczono także miejsce cięcia. Które z nich są względem siebie kompatybilne?

Ⴏ Bam H1 Ⴏ Eco R1 Ⴏ Hind III Ⴏ Bgl II

5'-GGATCC-3' 5'-GAATTC-3' 5'-AAGCTT-3' 5'-AGATCT-3'

3'-CCTAGG-5' 3'-CTTAAG-5' 3'-TTCGAA-5' 3'-TCTAGA-5'

Ⴍ Ⴍ Ⴍ Ⴍ

Przygotowanie:

MUTACJE!!!

Techniki:

Klonowanie: in vivo i in vitro: PCR

O3_Genetyka dla biol-mat. - budowa DNA, RNA, plazmidu - enzymy restrykcyjne,

---