UTLENIANIE BIOLOGICZNE I GROMADZENIE ENERGII
Utlenianie biologiczne określane też jako oddychanie jest końcowym etapem katabolizmu związków węgla i obejmuje utlenianie jednostki acetylowej w cyklu kwasu cytrynowego oraz łańcuch oddechowy -transport elektronów na tlen.
CYKL KWASU CYTRYNOWEGO
Cykl kwasu cytrynowego (CKC) zwany również cyklem kwasów trikarboksylowych (TCA) lub cyklem krebsa utlenia grupę acetylową (C2) wchodzącą do CKC jako acetylo-CoA, a elektrony i protony gromadzone są w zredukowanych przenośnych, NADH,FADH2, których reoksydacja w łańcuchu oddechowym dostarcza przewidzianych ilości energii w formie atp- fosforyzacja oksydacyjna.
●Główne źródła acetylo-CoA: pirogronian (glukoza), kwasy tłuszczowe…
Cykl obejmuje 8 etapów.
1)synteza cytrynianowi katalizuje nieodwracalną reakcji kondensacji acetylo-CoA(C2)ze szczawiooctanem (C4)i powstaje cytrynian (C6), metabolitem pośrednim jest cytrynylo-CoA
2)Akonitaza katalizuje izomeryzacje cytrynianu do izocytrynianu. Jest to reakcja 2 stopniowa w której metabolitem pośrednim jest cis akonityn i polega na odłączeniu H2O od cytrynianu i przyłączeniu H2O z utworzeniem (epimeru)izocytrynianu.
H
¯ OOC-C
¯OOC-C
CH2
COO¯
Cis-akoniton
3)Oksydacyjna dekarboksylacja izocytrynianu do 2-oksoglutaranu (α-ketoglutaran) przez dehydrogenaze izocytrynianową Redukowany jest NAD+ do NADH i odłączany jest CO2 ( z grupy karboksylowej). Metabolitem pośrednim jest nietrwały szczawiobursztynian.COO¯
CH2
H-C-COO¯
C=O
COO¯
4)Utlenienie 2-oksoglutaranu do bursztynylo-CoA i CO2 przez kompleks dehydrogenazy 2-oksoglutaranowej (3 enzymy) redukujący NAD+ do NADH Reszta bursztynianowa związana jest z CoA wysokoenergetycznym wiązaniem.
5)Przekształceniu bursztynylo-CoA w bursztynian przez syntetaze bursztynylo-CoA. Energia uwolniona podczas rozrywania wiązania w bursztynylo-CoA wykorzystywana jest do syntezy GTP(u zwierząt)lub ATP (tylko u roślin)-fosforylacja substratowi.
6)Utlenianie bursztynianu do fumaranu przez dehydrogenazę bursztynianową, redukowana jest grupa prostetyczna FAD do FADH2.∆Gº' reakcji jest za niska aby mógł być wykorzystany NAD+
7)Przekształcenie fumaranu w jabłczan przez fumarazę (hydroliza jabłczanowa) poprzez stereospecyficzne przyłączenie H+,OH- z wody.
8.Utlenienie jabłczanu do szczawiooctanu przez dehydrogenazę jabłczanową współdziałającą z NAD+ kończy cykl reakcji CKC. Sumaryczne równanie CKC: acetylo-CoA+ 3NAD++FAD+GDP+Pi+2H2O2CO2+3NADH+3H++FACH2+GTP+CoA-SH
Sumaryczną reakcją można zrekapitulować:
1.Podczas kondensacji szczawiooctanu z grupą acetylowi (acetylo-CoA)wchodzą do CKC dwa atomy węgla (reakcjia1) i opuszczają cykl 2 atomy wegla jako CO2(r.3 i4).
2.podczas 4 reakcj utleniania opuszczaja cykl 4 pary atomów wodoru. Redukowane SA 3 cząsteczki NAD+(r. 3,4,8)i jedna FAD(r.6)
3.kosztem wysokoenergetycznego wiązania trioestrowego w bursztynylo-CoA tworzy się 1 wysokoenergetyczne wiązanie fosforanowe (GTP)
4.zużywane są 2 cząsteczki wody : w trakcie syntezy cytrynianu do hydrolizy cytrynylo-CoA(r.1)i uwodnienia fumaranu (r.7)
NADH i FADH2 utlenione są w łańcuchu oddechowym czemu towarzyszy wytworzenie 2,5 i 1,5 cząsteczki ATP. Zatem suma energii zgromadzonej podczas utleniania 1 cz. Acetylo-CoA w CKC i reoksydacji koenzymów w łańcuchu oddechowym wynosi 10cz. ATP (NADH 3*2,5 ; FADH2 1,5 ; fosforyzacja substratowi w CKC 1GTP=1ATP)
Tlen nie uczestniczy bezpośrednio w CKC, lecz jest niezbędny do jego funkcjonowania ze względu na reoksydację koenzymów.
REGULACJA CKC
Na rys. pokazane są miejsca regulacyjne CKC.
●syntaza cytrynianianowa jest hamowana przez cytrynian i ATP (Km dla acetylo-CoA zwiększa się, gdy wzrasta poziom ATP).
●Dehydrogenaza izocytrynianowa hamowana przez NADH i ATP, aktywowana przez ADP
● Dehydrogenaza αhetoglutaranowa (2-oksoglutaranowa)jest hamowana przez NADH i bursztynylo-CoA.
Do mechanizmu regulacyjnego CKC włączona jest też dehydrogenaza pirogronianowa nie uczestnicząca w reakcjach cyklu lecz dostarczająca substratu dla jego działania -acetylo-CoA. Enzym hamowany jest przez produkty ; NADH i acetylo-CoA. U eukariotów regulowana jest aktywność także przez fosforyzację(nieaktywna) i defosforylację (aktywna). Wzrost wartości stosunku NADH\NAD+, acetylo-CoA\CoA oraz ATP\ADP stymuluje fosforyzację enzymu. Nagromadzenie się pirogronianu hamuje kinezę (enzym fosforyzujący ), co umożliwia działanie fosfatazy, która przywraca aktywność enzymu i stymuluje wytwarzanie acetylo-CoA. Zatem, CKC przebiega szybciej, gdy jest niski poziom energii w komórce (duże stężenie ADP, a małe ATP i NADH),a obniża się jego szybkość przy wysokim stężeniu ATP (a także NADH,bursztynylo-CoA i cytrynianu).
Inne funkcje CKC
Metabolity pośrednie CKC są prekursorami dla różnych biosyntez
●bursztynylo-CoA do syntezy układu porfirynowego
●szkielety węglowe aminokwasów ; szczawiooctanu-Asp, 2-oksoglutationu-Glu.
●szczawiooctan może być przekształcony w glukoneogenezie w glukozę
reakcje anaploretyczne CKC, np. karboksylacja pirogronianu; pirogronian+CO2+ATP+H2O---karboksylazaszczawiooctan +ADP+Pi
●inne metabolity wchodzące do CKC
TRANSPORT ELEKTRONÓW PRZEZ ŁAŃCUCH ODDECHOWY I FOSFORYZACJA OKSYDACYJNA
U EUKARIOTÓW TRANSPORT ELEKTRONÓW I FOSFOTYLACJA OKSYDACYJNA ZACHODZĄ w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, a u prokariotów w błonie komórkowej.
W łańcuchu oddechowym reoksydowane są NADH iFADH2 wytworzone w CKC, glikolizie, β-oksydacji kwasów tłuszczowych, a uwolniona energia w znaczącym stopniu jest wykorzystywana do syntezy ATP-fosforylacja oksydacyjna. Transport elektronów w łańcuchu oddechowym jest reakcją oksyderedukcyjną (redoks) gdy, np. NADH oddaje elektrony i jest utleniany do NAD+ , to tlen przyjmująć elektrony jest redukowany do wody. Miarą powinowactwa substancji do elektronów jest jej potencjał oksydoredukcyjny w stosunku do wodoru. Substancja o dodatnim potencjale redoks ma wieksze powinowactwo do elektronów niż wodór i przyjmuje elektrony do wodoru. Natomiast substancja o ujemnym potencjale redoks oddaje elektrony od H+ i powoduje H2. np., NADH jest silnym reduktorem i ma ujemny potencjał redoks, a tlen jest silnym utleniaczem o dodatnim potencjale redoks z tendencją do przyjmowania elektronów. Dla warunków biologicznych standardowy potencjał redoks mierzy się w pH 7 i wyrażona w woltach. Standardową zmianę energi swobodnej ∆Gº'= -nF*∆Eo'
Gdzie; n- liczba przenoszonych elektronów
∆Eo'-zmiana potencjału w woltach
∆Gº'-wkJ*mol¯1
F- stała faradaja (96,556kJ*V¯1*mol¯1)
Reakcja o dodatniej ∆Eo' ma ∆Gº'ujemna (egzoergiczną )
●obliczenie ∆Gº na podstawie ∆Eo' reakcjiporównując energetyke NADH(-220kJ*mol¯1)z energetyką syntezy ATP(+30,5kJ*mol¯1 ) widać że uwolniona energia wystarcza do syntezy kilku cząsteczek ATP. Do syntezy cząsteczki ATP potrzeba zmiany potencjału redoks w pojedynczej reakcji co najmniej 0,16V (por. niżej)jednakże utlenianie NADH i synteza ATP nie są pojedynczymi reakcjami, gdyż elektrony nie są przenoszone bezpośrednio na tlen. W komórce są one transportowane z NADH na tlen wzdłuż przenośników przenośników wzrastającej wartości potencjału redoks nazywanych wspólnie łańcuchem transportu elektronów lub łańcuchem oddechowym. Łańcuch oddechowy obejmuje 3 duże kompleksy białkowe zanurzone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej; reduktaza NADH-CoQ, reduktaza cytochromowa i oksydaza cytochromowa oraz 2 małe ruchome przenośniki elektronów pełniące funkcje łączników; ubichinon nazywany tez koenzymem Q (CoQ lub Q) i cytochrom C.
●reduktaza NADH-Q nazywana tez dehydrogenazą NADH zawiera co najmniej 34 łańcuchy polipeptydowi. Wiąże ona NADH i utlenia do NAD+, przekazuje 2 elektrony i 2H+do FMN, powstaje FMNH2. dalej elektrony przechodzą wewnątrz kompleksu przez centra żelazowo siarczkowe (FeS) białek żelazowo-siarczkowych (drugi typ grupy prostetycznej), a następnie przez CoQ przechodzi do 2 centrum żelazowo-siarczkowego. Niehemowe żelazo uczestniczące w przenoszeniu elektronów podlega zmianom; Fe3+-Fe2+
●ubichinon łącznikowy elektrony z centrów żelazowo-siarczkowych reduktazy NADH-CoQ przenoszone są na ruchomą cząsteczke ubichinonu (pula rozpuszczalnego w tłuszczach CoQ wewnętrznej błony mitochondrialnej).przyjmując 2 e¯i 2H+ CoQ przekształcą się w ubichinol(CoQH2). Za pośrednictwem CoQ przenoszone są także elektrony i H+ z NADH2 wytworzonego, np. w reakcji dehydrogenazy bursztynianowej. Enzymy przenoszące elektrony z FADH2 na CoQ nie jonizują H+ do przestrzeni międzybłonowej, ze względu na zbyt małą zmianę energii swobodnej. Dlatego utlenianie FADH2 dostarcza mniej cząsteczek ATP niż utlenianie NADH. Na rys.obok reakcja redoks z udziałem CoQ.
●reduktaza cytochromowa określana również jako reduktaza ubichinol-cytochrom C , bądź też kompleks cytochromów bc1. cytochromy są białkami transportującymi elektrony zawierają różne grupy hemowe jako grupy prostetyczne. Na rys. obok pokazana jest budowa grupy hemowej cytohromu C. znanych jest kilka typów cytochromów w których elementem czynnym jest atom żelaza hemu w formie utlenionej Fe3+i podlegają cyklicznym zmianom :Cyt-Fe3+Cyt-Fe2+
reduktaza cytochromowa zawiera 2 typy cytochromów b i c1oraz białka żelazowo-siarkowe i przenosi elektrony z ubichinolu do kompleksu Fe-S enzymu, a poprzez cytochrom C1 na cytochrom C. reakcja przebiega stopniowo, gdyż CoQH2 jest donorem 2 elektronów, a cytochrom C może przyjąć jeden elektron. Dlatego niezbędny jest udział cytochromu b zawierającego dwie grupy hemowe, a związkiem pośrednim jest ubisemichinom(CoQ-), który po odłączeniu drugiego elektronu przechodzi powrotem w ubichinom(CoQ). Na tym etapie pompowane są H+ z matriks do przestrzeni międzybłonowej.
●Cytochrom C łącznikowy jest luźno związany z wewnętrzną błoną mitochondrialną i pośredniczy w przenoszeniu elektronów od reduktazy cytochromowej do oksydazy cytochromowej. Wiąże się z reduktazą cytochromową, odbiera elektron, a następnie wiąże się z oksydazą cytochromową i przekazuje jej elektron przechodzi ze stanu Fe2+ doFe3+. Na tym etapie nie są pompowane H+ do przestrzeni między błonowej.
●Oksydaza cytochromowa zawiera 2 rodzaje cytochromów „a i a3” oraz dwa jony miedzi nazwane CuA i CuB różniące się sposobem związania z białkiem. Cytochrom a stanowi parę z atomem CuA, a cytochrom a3 występuje w parzez z atomem CuB. Oksydaza cytochromowa katalizuje ostatni etap łańcucha oddechowego, przenosząc cztery elektrony z czterech cząsteczek cytochromu C na akceptor końcowy, którym jest tlen cząsteczkowy:
4cyt c (Fe2+)+4H+ +O24cyc c (Fe3+)+2H2O
podczas przenoszenia elektronów atomy żelaza hemu oscylują między atomem Fe3+ a Fe2+, a atomy miedzi miedzy atomem Cu2+ i Cu+. W czasie reakcj tlen wiąże się z cytochromem a3-CuB między Fe2+ a CU+.
Przyjęcie czterech elektronów przez O2 powoduje jego redukcję do H2O z równoczesnym wypompowaniem H+ do przestrzeni międzykomórkowej mitochondrium.
Tworzenie gradientu H+
W łańcuchu oddechowym przenośniki elektronów odziaływują wzajemnie zgodnie z ich potencjałem redoks. Przenośnik przyjmujący elektrony ma większe powinowactwo do elektronów niż oddający. W ten sposób elektrony przepływają od NADH o najmniejszym powinowactwie do O2 o najwyższym powinowactwie do elektronów. Podczas przepływu elektronów w łańcuchu oddechowym spada potencjał redoks( staje się bardziej dodatni ), ale największy spadek następuje w trzech miejscach odpowiedzialnych trzem głównym kompleksom białkowym: reduktaza NADH-Q, reduktaza cytochromowa i oksydaza cytochromowa. Zmiana energi swobodnej tylko w tych miejscach jest wystarczająco duz a do wypompowania odpowiednio 4,2 i 4H+ z matriks mitochondrialnej poprzez wewnętrzną błone mitochondrialna do przestrzeni między błonowej (rys obok). Każdy z tych 3 kompleksów jest pompą pretonową napędzana przez transport elektronów. Podczas transportu wytwarzana energia wykorzystywana jest do tworzenia grodieretu H+w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej.
Inhibitory transportu elektronów
Przenośniki łańcucha oddechowego mogą być specyficznie hamowane. Na przykład:
●amytol (preparat barbituranowy ) hamuje aktywność reduktazy NADH-CoQ,
●antymycyna A hamuje transport elektronów przez reduktazę cytochromową
●cyjanek (CN-) i azydek (N3-)reagują z formą Fe3+hemu a3, a tlenek węgla (CO)z formą Fe2+oksydazy cytochromowej.
Fosforyzacja oksydacyjna
Jest to proces syntezy ATP (fosforyzacja zachodzący wówczas, gdy NADH i FADH2 sa utleniane dzieki transportowi elektronów przez łańcuch oddechowy. Hipoteza chemiosmotyczna (michell,1960) zakłada że energia uwolniona podczas transportu elektronów jest wykorzystywana do tworzenia w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej gradientu protonowego. Wypompowanie H+ generuje ich wysokie stężenie w przestrzeni międzybłonowej i tworzy potencjał elektryczny wewnętrznej błony mitochondrialnej, który ma wartość dodatnia po stronie zwróconej ku przestrzeni miedzybłonowej i ujemny po stronie matriks mitochondrialnej. W ten sposób powstaje elektrochemiczny gradient protonowy. Syntezę ATP napędza siła protonomotoryczna, która składa się z gradientu pH ( niższe po stronie zewnętrznej ) i i elektrycznego potencjału błonowego w poprzek błony. Proces fosforyzacji ADP do ATP zachodzi w skutek powrotnego przepływu H+ matriks mitochondrialnej przez syntezę ATP zakotwiczona w wewnętrznej błonie mitochondrialnej:
ADP+Pi+H+ATP+H2O
Syntezę 1 cząsteczki ATP napędzają 3H+ przechodzące przez syntazę ATP. Ponieważ podczas transportu ATP z mitochondrium do cytozolu zostaje popbrany dodatkowy H+ więc należy przyjąć, że w skutek przeniesienia 2 elektronów z NADH na O2 powstaje 205 cząsteczki ATP, a z FADH2 wchodzącego na poziomie drugiej pompy protonowej 1,5 cząsteczki ATP przemieszczonego do cytozolu.
Sprzężenie i kontrola oddechowa
Transport elektronów jest zazwyczaj sprzężony z syntezą ATP. Fosforyzacja oksydacyjna wymaga NADH lub FADH2, ADP, Pi i tlenu, a jej szybkość zależy od dostępności ADP.jeżeli cały ADP zostanie ufosforylowany do ATP, to przestaje działać łańcuch oddechowy, gromadzi się NADH, FADH2, cytrynian i zostaje zahamowane CKC i glikoliza. Taki mechanizm przepływu elektronów i zużycia tlenu przez ADP nazwano kontrolą oddechową, która gwarantuje, że elektrony przepływają przez łańcuch oddechowy tylko wtedy, kiedy potrzebna jest synteza ATP.
Rozprzęganie przepływu elektronów i syntezy ATP
Niektóre związki np. 2,4-dinitrofenol działaja jako czynniki rozprzęgające, gdyż wprowadzone do komórek hamują syntezę ATP,a nie hamują transportu elektronów, zużywany jest tlen i pompowane są H+ do przestrzeni międzybłonowej. Takie drobno cząsteczkowe związki rozpuszczają się w lipidach, wiążą H+ i przenoszą je z powrotem do mitochondrium, a więc są jonoforami H+. ponieważ nie powstaje gradient H+, więc nie zachodzi synteza ATP na drodze fosforyzacji oksydacyjnej, a uwolniona energia z transportu elektronów pojawia się w postaci ciepła.
Wytwarzanie ciepła przez mechanizm rozprzęgający ma w niektórych sytuacjach duże znaczenie biologiczne i nazwane jest „bezdrieniową” termogenezą iw brunatnej tkance tłuszczowej jest procesem naturalnym. W tkance tej występują mitochondria zawierające w błonie wewnętrznej termogeninę (białko rozprzęgające), która umożliwia powrotny przepływ H+do mitochondrium, czyli rozprzęga przepływ elektronów do fosforyzacji oksydacyjnej, generując ciepło zamiast ATP.
●znaczenie tego zjawiska u zwierząt.
Utlenianie cytoplazmatycznego NADH
Wewnętrzna błona mitochondrialna jest nie przepuszczalna dla NADH powstającego powstającego cytozolu w glikolizie, który musi być redukowany. Cytozolowy NADH jest utleniany, a elektrony są przenoszone wraz z protonami do łańcucha oddechowego za pośrednictwem tak zwanego czółenka błonowego. Na rys. wyzej przedstawiony jest mechanizm działania czółenka glicerolo-3-fosforanowego. Fosfodichydroksyaceton jest redukowany w cytozolu z udziałem dehydrogenazy do glicerolo-3-fosforanu i NADH jest reoksydowany do NAD+. Glicerolo-3-fosforan dyfunduje do wewnętrznej błony mitochondrialnej, gdzie jest z powrotem utleniany do fosfodihydroksyacetonu przez dehydrogenazę, białko trans błonowe błony wewnętrznej. Fosfodihydroksyaceton z powrotem dyfunduje do cytozolu. Enzym błonowy zawiera FAD, który po redukcji do FADH2 ulega reoksydacji przez przeniesienie elektronów do łańcucha oddechowego za pośrednictwem ubichinolu. Ponieważ elektrony z cytozolowego NADH wchodza do łańcucha oddechowego oddechowego FADH2, więc powstaje tylko 1.5 cząsteczki ATP zamiast 2,5 w przypadku mitochondrialnego NADH. Podobne czółenko jabłczanowo-asparaginianowe działa w sercu i wątrobie, jednakże tu elektrony przenoszone są z cytozolowego NADH do mitochondrialnego NADH.