ćwiczenie3

Identyfikacja bakterii kwasu mlekowego za pomocą PCR

Techniki biologii molekularnej mają obecnie bardzo szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach życia m.in. w rolnictwie, medycynie i kryminalistyce, a także podczas genotypowania ważnych użytkowo szczepów bakteryjnych w przemyśle spożywczym. Jedną z często wykorzystywanych metod oznaczania przynależności taksonomicznej bakterii jest określenie zawartości C+G w genomach analizowanych gatunków, a także analizowanie aktywności enzymów różnicujących dane szczepy. Identyfikacji takiej nie możemy jednak przeprowadzić w próbce zawierającej różne gatunki bakterii. W tym przypadku, do genotypowania należy zastosować techniki oparte na amplifikacji metodą PCR rejonów zmiennych genomowego DNA, które będą wystarczająco różnicować analizowane szczepy. Jednym z molekularnych markerów używanych w detekcji i identyfikacji szczepów bakteryjnych również w warunkach klinicznych jest obecnie 16S rRNA, chociaż z uwagi na zachowawczość sekwencji tradycyjnie był on używany w analizach filogenetycznych w celu wykrycia określonego pokrewieństwa pomiędzy różnymi bakteriami. Techniki z zastosowaniem PCR znalazły obecnie szerokie zastosowanie do szybkiego i specyficznego wykrycia wielu gatunków bakterii i pozostają kluczowymi metodami detekcji mikroorganizmów. Co więcej, pozwalają one na identyfikację gatunków bez uprzedniego założenia hodowli określonego mikroorganizmu, oraz na identyfikację bakterii wolno rosnących na pożywkach mikrobiologicznych lub trudno rozróżnialnych szczepów za pomocą metod klasycznych.

Wykorzystanie technik biologii molekularnej w mikrobiologii środowiska oraz mikrobiologii przemysłowej umożliwia pełniejszą charakterystykę szczepów bakteryjnych i nie powoduje wprowadzenia błędów typowych dla tradycyjnych metod mikrobiologicznych. Jednym z największych atutów metod molekularnych jest szybkość i czułość genotypowania, której się nie osiągnie podczas stosowania metod tradycyjnych, gdzie jedynie mała część populacji bakterii może być zidentyfikowana. Co więcej, podczas wykorzystania metod tradycyjnych nawet do 99% szczepów bakteryjnych z różnych ekosystemów nie wykazuje wzrostu w warunkach in vitro. Wynika to z faktu, że warunki wzrostu i hodowli wielu gatunków bakterii są ciągle nieznane i nie mogą być zastosowane w warunkach laboratoryjnych.

Bakterie kwasu mlekowego, takie jak Lactobacillus oraz bifidobakterie to Gram dodatnie, nie wytwarzające zarodników, względnie beztlenowe bakterie, u których kwas mlekowy jest głównym produktem fermentacji węglowodanów. Uważa się, że Lactobacillus i Bifidobacteria zawarte m.in. w jogurcie oraz w produktach żywnościowych dla dzieci, stymulują wzrost i rozwój innych bakterii sprzyjających zdrowiu i dlatego mają one charakter probiotyczny. Bifodobakterie są pospolitymi komensalami przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt. Kolonizują one przewód pokarmowy wkrótce po narodzinach i przeważają w składzie mikroflory jelitowej dzieci. W miarę starzenia się, zmniejsza się liczebność i skład populacji bifidobakterii. Z filogenetycznego punktu widzenia, bifodobakterie stanowią odrębną grupę w porównaniu z Lactobacillus, co potwierdzono stosując różnorodne techniki biologii molekularnej, takie jak np. hybrydyzację z wykorzystaniem sond specyficznych gatunkowo, czy użycie specyficznego gatunkowo PCR. Nie zawsze wyniki analiz molekularnych są zbieżne z sugerowanym pokrewieństwem filogenetycznym. Generalnie jednak techniki oparte na PCR umożliwiają bezpośrednią identyfikację szczepu w analizowanych próbkach.

Celem ćwiczenia jest identyfikacja bakterii kwasu mlekowego Lactobacillus w dostarczonych preparatach zawierających bakteryjny genomowy DNA izolowany z próbek jogurtu. Do oznaczania bakterii metodą PCR zostaną użyte startery oznaczone jako LAA, amplifikujące fragmenty 16S rRNA specyficzne dla Lactobacillus, a także startery uniwersalne (oznaczone jako Unibac), namnażające zachowawczy rejon 16S rRNA, które identyfikują większość znanych gatunków bakterii. Produkt reakcji PCR z zastosowaniem starterów uniwersalnych posiada długość 611 pz. Startery specyficzne dla rodzaju Lactobacillus powodują powstanie produktu PCR o długości 286 pz, co umożliwia łatwą identyfikację tych bakterii.

Wykonanie ćwiczenia:

UWAGI:

1. Ćwiczenie wykonujemy przy 4 stanowiskach (stołach) w sali M1. Przy każdym stanowisku powinny się znaleźć 3-4 osoby.

2. Ćwiczenie rozpoczynamy od przygotowania PCR z wykorzystaniem preparatów DNA dostarczonych przez prowadzącego ćwiczenia. Praca wyłącznie w rękawiczkach ! Na każdym stanowisku pracy przygotowujemy 3 reakcje PCR (p. poniżej): 2 reakcje właściwe (z genomowym DNA) oraz reakcję kontrolną (zawierającą zamiast DNA wodę). Na dwóch wybranych stanowiskach wykonujemy PCR ze starterami LAA, a na dwóch pozostałych- ze starterami Unibac.

3. W trakcie PCR prowadzimy izolację DNA bakteryjnego z dostarczonych próbek jogurtu. Izolację rozpoczyna część studentów na każdym stanowisku od p. 6-14. wykorzystując ekstrakt po trawieniu proteinazą K, który został przygotowany przez poprzednią grupę. Druga część grupy prowadzi izolację DNA od p. 1-5 i zostawia próbki jogurtu w obecności proteinazy K, jak opisano w p.5, dla następnej grupy.

1. Izolacja DNA genomowego bakterii kwasu mlekowego z próbek jogurtu

Metoda oparta na: Spanova A, Rittich B., Benes MJ, Horak D (2005) Ferrite supports for isolation of DNA from complex samples and polymerase chain reaction amplification, J. Chrom. A, 1080: 93-98.

UWAGA- izolację w danym dniu rozpoczynamy od p. 6-14 wykorzystując ekstrakty przygotowane przez poprzednią grupę. W czasie przeprowadzania PCR zaczynamy izolację DNA od p. 1-5 dla następnej grupy.

1. 10 g jogurtu rozcieńczyć sterylną wodą do objętości końcowej 10 ml.

2. 1 ml rozcieńczonego jogurtu wirować przez 5 min. przy 10000 x g (temp. pokojowa).

3. Usunąć supernatant, osad zawiesić w 1 ml sterylnej wody i zwirować 5 min. przy 10000 x g.

4. Usunąć supernatant, osad zawiesić w 1 ml buforu lizującego (10 mM Tris-HCl pH 7.8; 5 mM EDTA pH 8.0; 3 mg/ ml lizozym). Całość pozostawić w temp. pokojowej przez 1 godz.

5. Dodać 10 µl proteinazy K (1 mg/ ml) i 50 µl 20% SDS, całość inkubować przez 3 godz. w temp. 55°C.

6. Lizat po zakończeniu trawienia proteinazą K ekstrahować jeden raz 1 obj. mieszaniny fenol/ chloroform (1:1) przez 2 min. i zwirować w mikrowirówce przez 5 min. przy 12000 rpm.

7. Fazę wodną (górną) przenieść ściętym tipsem (uwaga na mechaniczną degradację DNA!) do nowej probówki Eppendorfa, i powtórzyć cała rundę ekstrakcji z 1 obj. mieszaniny fenol/ chloroform (1:1) zgodnie z p.6. Podczas wszystkich rund ekstrakcji należy założyć rękawiczki (praca z odczynnikami organicznymi).

8. Po zwirowaniu i przeniesieniu fazy wodnej do świeżej probówki (zawsze ściętym tipsem), do fazy wodnej dodać 1 obj. chloroformu i ekstrahować przez 2 min.

9. Po zwirowaniu 5 min. przy 12000 rpm, przenieść fazę wodną ściętym tipsem do nowej probówki Eppendorfa.

10. Powtórzyć jeszcze raz ekstrakcję z 1 obj. chloroformu.

11. Po zwirowaniu i przeniesieniu fazy wodnej ściętym tipsem do świeżej probówki, DNA genomowy wytrącić 0.2 obj. 10 M octanu amonu i 2.5 obj. etanolu 96% przez 20 min. w -20^oC.

12. Wytrącony DNA zwirować przy 12000 rpm w mikrowirówce przez 10 min., przemyć 70% etanolem i ponownie zwirować przez 5 min.

13. Osad DNA po wysuszeniu w temperaturze pokojowej zawiesić w 20 µl sterylnej wody.

14. Zanalizować elektroforetycznie izolowane próbki DNA na 0,8 % żelu agarozowym (na żel nakładać od 1/10 do 1/20 obj. preparatu). Ocenić jakość DNA genomowego.

2. Identyfikacja Lactobacillus metodą PCR

Metoda oparta na : Amit- Romach E, Sklan D, Uni Z (2004) Microflora ecology of the chicken intestine using 16 S ribosomal DNA primers, Poultry Sci., 83: 1093-1098.

1. Praca w rękawiczkach ! Przygotować 3 probówki do PCR i oznaczyć je w następujący sposób:

• stanowiska ze starterami LAA (L): KL, EL, JK

• stanowiska ze starterami Unibac (U): KU, EU, JU

K- kontrola negatywna (brak matrycy PCR, czyli DNA genomowego)

E- PCR z wykorzystaniem DNA genomowego E. coli (szczep DH5α)

J- PCR z wykorzystaniem DNA izolowanego z próbek jogurtu

2. Do probówek KL i KU podać po 8,8 µl sterylnej wody. Do probówek EL i EU podać po 1 ul (20 ng) genomowego DNA E. coli i wodę 7,8 ul (do obj. całkowitej 8,8 µl). Do probówek JK i JU podać po 1 ul (20 ng) DNA izolowanego z jogurtu i wodę 7,8 ul (do obj. całkowitej 8,8 µl) do obj. całkowitej 8,8 µl.

3. Przygotować mieszaninę reakcyjną (Mix) na 4 próby reakcyjne. Uwaga- dwa stanowiska przygotowują mieszaninę L (oznaczyć jako MixL), zawierającą tylko startery LAA, natomiast kolejne dwa mieszaninę U (oznaczyć jako MixU), zawierającą tylko startery Unibac. Każdy Mix zawiera: 8 µl 10x stężonego buforu do PCR, 8 µl mieszaniny nukleotydów (2 mM dNTP), 12 µl 10 mM MgCl₂, po 5 µl każdego z niezbędnych starterów (dostarczonego w postaci roztworu o stęż. 5 µM) oraz 0,65 µl polimerazy Taq (2,5U/ µl). W tabeli poniżej zamieszczono końcowe stężenia składników reakcji PCR:

Składniki	Stężenie lub ilości początkowe składnika	Stężenie lub ilości końcowe w reakcji PCR	Objętość (µl)
DNA genomowy	-	1 ng/ µl (20 ng) - tylko próby właściwe
woda	-	-	?
bufor polimerazy Taq	10 x st.	1 x st.	2 µl
MgCl2	10 mM	1.5 mM	3 µl
mieszanina dNTP	2 mM	0.2 mM	2 µl
starter F * (wprost)	5 µM	0.5 µM	2 µl
starter R * (wspak)	5 µM	0.5 µM	2 µl
polimeraza Taq	2U / µl	1 U na reakcję	0,65 µl
obj. końcowa	-	-	20 µl

Startery uniwersalne:

Unibac- F (wprost) 5' - CGTGCCAGCCGCGGTAATACG -3'

Unibac- R (wspak) 5' - GGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT -3'

Startery na obecność Lactobacillus:

LAA- F (wprost) 5' - CATCCAGTGCAAACCTAAGAG -3'

LAA-R (wspak) 5'- GATCCGCTTGCCTTCGCA -3'

4. Przenieść po 11,1 µl z odpowiedniego mixu do prób kontrolnych i prób właściwych zawierających genomowy DNA. Delikatnie mieszać i całość krótko zwirować. Próby włożyć do termocyklera Applied Biosystems.

5. Reakcję PCR przeprowadzamy zgodnie z poniższym profilem termicznym (dla wszystkich par używanych starterów):

94^oC - 3 min.

30 cykli:

94^oC - 30 s

60^oC - 1 min.

68^oC - 2 min.

68^oC - 7 min.

4. Pozakończeniu PCR, produkty reakcji analizujemy na 2% żelu agarozowym zawierającego bromek etydyny (UWAGA! MUTAGEN! PRACA BEZWZGLĘDNIE W RĘKAWICZKACH!). Do prób po PCR dodajemy 3 µl obciążacza DNA, starannie mieszamy i nakładamy całość na żel agarozowy. Elektroforezę prowadzimy przez 1 godz. w buforze 1 x TBE przy napięciu 10 V/ cm wobec wzorca masy cząsteczkowej. Produkty amplifikacji analizujemy w świetle UV.

4. Czy w otrzymanych próbkach występują bakterie kwasu mlekowego? Dlaczego wynik PCR z DNA E. coli i starterami LAA jest negatywny?

3

---