Temat 2: Diagnostyka molekularna chorób genetycznych cz I.. Zastosowanie technik biologii molekularnej w diagnostyce chorób.

1. Pozyskiwanie DNA do celów diagnostycznych.

2. Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego.

3. Zasady izolacji DNA i RNA

4. R. Łańcuchowe polimerazy PCR

5. Analiza produktu r. PCR

6. Ocena ekspresji genów z zastosowaniem mikro- i makromacierzy DNA

Materiał wyjściowy do izolacji DNA

• pełna krew obwodowa

• komórki płynu owodniowego

• komórki kosmówki

• fibroblasty skory pochodzącej z hodowli

• komórki epitelialne

• cebulki włosowe

• plamy krwi, nasienie

• wycinki tkanek np. tk. Nowotw. Uzyskiwane pooperacyjnie, pobrane met. Biopsji cienkoigłowej

• szpik kostny

• płyn mózgowo-rdzeniowy

Krew pobieramy na antykoagulant (EDTA, 2,3 ml krwi)

Przechow. - w temp 4 st. do 48 godz, jeśli od pacjenta - zamrażamy do - 70 st

Plamy z wydzieliny w temp. pokojowej

Wyizolowany DNA w temp - 4st, jeśli dłużej przechow. to w - 20st

• Etapy izolacji DNA met. fenolowa

1. pobieranie krwi obwodowej na EDTA

2. oddzielenie osocza przez wirowanie

3. liza erytrocytów

4. liza leukocytów z wykorzystaniem detergentu jonowego np. SDS, która rozpuszcza bł. kom.

5. trawienie białek przy użyciu proteinazy K w temp 37st., 24- 48 godz. (najczęściej przez noc)

6. oczyszczenie lizatu mieszanina fenol- chloroform- oktanol (25:24:1)

7. precypitacja DNA (wytracanie) 96% etanolem

8. zawieszenie preparatu DNA w buforze, który zabezpiecza przed działaniem endonukleaz

DNA otrzymany tą met. może być wykorzystany w podst. badaniach diagnostycznych z zakresu biologii molekularnej.

Zalety met. Fenolowej

• dobra wydajność - otrzymuje się DNA o dużym stężeniu

• wysoka czystość otrzymanego preparatu

• możliwość izolacji DNA z krwi długo przechowywanej (ok. 1 roku)

Wady met. Fenolowej

• długi czas izolacji - 2-3 dni

• naraża na prace z toksycznymi odczynnikami

• Metoda z odsalaniem białka

Różnice w stosowaniu do metody fenolowej

• wyższa temperatura inkubacji z proteinaza K - 55st

• skrócony czas trwania do 12- 24 godz., a tym samym i czas uzyskania preparatu DNA

• odbialczenie DNA zachodzi w wyniku odsalania białek poprzez odwodnienie i wytracenie z użyciem nasyconego roztworu NaCl

• precypitacja 70%etanolem

Zalety stosowania metody wysalania

• prosta i tania

• krótszy czas izolacji - 2 dni

• rezygnacja z toksycznych odczynników

• możliwość zmniejszenia ilości pobranej krwi

Wada: niska wydajność izolacji DNA z krwi długo przechowywanej

• Metoda Grimberga

Zalety

• rezygnacja z fenolu i chloroformu

• krotki czas izolacji - 6godz

• duża wydajność

• możliwość uzyskiwania DNA z bardzo małych ilości krwi ok. 1 ml

Wady:

• zanieczyszczenie preparaty DNA glikozoaminoglikanami, brak zanieczyszczeń RNA i białkami

• nie nadaje się do izolacji z izotiocyjaninem guanidyny

• Metoda izolacji z izotiocyjaninem guanidyny

Zalety:

• krotki czas wykonywania - kilka godz.

• wydajność przekracza prawie 2- krotnie wydajność tradycyjnej met. Fenolowej

Metoda izolacji za pomocą gotowych zestawów odczynnikowych tzw. KIT-ow

Gotowe zestawy służą do szybkiej i uproszczonej izolacji DNA, upraszczają procedury, ale są bardzo drogie.

• Ocena ilości i jakości wyizolowanego DNA

Na podstawie pomiaru absorpcji 260nm oblicza się stężenie preparatu DNA wg. wzoru

Z= A₂₆₀ x 50 x R

Z - stężenie wyizolowanego DNA w roztworze (ug/ml)

R - rozcieńczenie

50 - stały współczynnik dla dwuniciowego DNA. Jedna jednostka absorpcyjna równa się 50 ug DNA/ml

Częstość preparatu ocenia się na podstawie proporcji wartości absorbancji przy długości fali 230 nm, 260nm, 280nm.

Uzyskany preparat DNA charakteryzuje się wartości.

A₂₆₀/A₂₈₀ wynosząca 1,7- 2,0

A₂₆₀/A₂₈₀ <2 preparat zanieczyszczony RNA i białkiem

A₂₆₀/A₂₃₀ >2 preparat zanieczyszczony mukopolisacharydami

Izolacja RNA:

1. pobranie krwi na antykoagulant (EDTA)

2. „zbieranie” leukocytów - nawarstwianie fikolu

3. Odwirowanie - pozostaje zawiesina leukocytów

4. Płukanie leukocytów w roztworze PBS

5. Wirowanie

6. Dodanie PBS i tiocyjanianu guanidyny

7. Wirowanie

8. Właściwe oczyszczanie - dodajemy azotanu sodu, fenolu i mieszaniny chloroformu z alkoholem izoamylowym

9. Inkubacja 0C przez 15min

10. Wirowanie i płukanie alkoholem

11. Przechowywanie w buforze lub sterylnej wodzie

Oznaczenie stężenie spektrofotometrycznie

Technika sekwencjonowania na żelach (elektroforeza)

DNA migruje w kierunku bieguna dodatniego

Najmniejszą rozdzielczość mają żele agarozowe - 0,1-60kpz

Wykorzystanie:

• Sprawdzenie, jaki preparat DNA uzyskaliśmy

• Czy badane DNA zostało pocięte przez enzymy

• Do oceny reakcji PCR

Żel poliakrylamidowy: duża rozdzielczość, >0,1 kpz,

Żele PAGE - do rozdziału DNA otrzymanych podczas sekwencjonowania, gdzie cząsteczki DNA różnią się od siebie o 1 nukleotyd

Łańcuchowa reakcja polimerazy

PCR- enzymatyczna amplifikacja in vitro fragmentu genów DNA o długości od kilkudziesięciu do kilku tysięcy par zasad.

Startery - jednoniciowe oligonukleotydy (ok. 20 zasad), syntetyzowane chemicznie Sekwencja nukleotydów jest komplementarna do końców 3' obu nici wybranej sekwencji matrycowego fragmentu DNA, które ma być powielona z wielokrotnej kopii.

Amplifikacja DNA w reakcji PCR odbywa się przy udziale polimerazy DNA wyizolowanej z termofilnych bakterii np. polimeraza Tag z Thermas aquaticus jest aktywna w mieszaninie reakcyjnej o temp. 95 st.

Reakcja PCR prowadzona jest w cyklach powtarzających się 20 - 40 razy. W każdym cyklu następuje etap denaturacji cząsteczki DNA, przyłączanie starterów i syntezy nowej nici DNA. Każdy etap zachodzi w innej temperaturze i trwa ok. 15- 60 sek.

Reakcja zachodzi w próbówce umieszczonej w bloku grzejnym (termocykler), który umożliwia szybka i precyzyjna zmianę temperatury, właściwa dla poszczególnych etapów procesu PCR.

Skład mieszaniny reakcyjnej:

• Matrycowy DNA (lub RNA)

• Startery komplementarne do łańcucha i ograniczające długość syntetyzowanego łańcucha

• Tri fosforany czterech deoksyrybonukleotydów (dNTP)

• Termostabilna polimeraza Taq

• Odpowiedni bufor

• Jony Mg²⁺ - ko faktor aktywności enzymatycznej polimerazy

Objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 20-100ul

Etapy reakcji PCR:

• Denaturacja matrycowego DNA w temperaturze 94C

• Przyłączanie starterów do jednoniciowych matryc DNA w temperaturze 40-68C (im więcej par GC tym wyższa temperatura przyłączania)

• Synteza DNA - wydłużanie starterów przy udziale polimerazy Taq w temperaturze 72C z wykorzystaniem dNTP - elongacja

Podniesienie temperatury 72C po zakończeniu elongacji do temperatury denaturacji DNA rozpoczyna kolejny cykl, proces ten może być powtarzany 25-40x. Po każdym cyklu następuje podwojenie amplifikowanego materiału. Nowo powstające produkty PCR są również matrycą do syntezy następnych. Końcową ilość namnożonych kopii fragmentu DNA można obliczyć ze wzoru:

I=I₀x2ⁿ ,gdzie:

I, I₀ - końcowa i początkowa ilość kopii powielanego odcinka DNA

n - ilość cykli

zalety:

• Szybka do przeprowadzenia: 2,5-4h

• Klonowanie pojedynczych genów

• b. duża czułość i specyficzność metody

wady:

• b. duża czułość i specyficzność (przy zanieczyszczonej próbce, może to prowadzić do błędnych wyników)

zastosowania PCR:

• wykrywanie patogenów infekcyjnych: bakterii, wirusów, pasożytów

• wykrywanie zmian w genomowym DNA w chorobach genetycznych

• preimplantacja i prenatalna diagnostyka chorób genetycznych

• wykrywanie uszkodzeń DNA spowodowanych czynnikami środowiskowymi

• wykrywanie predyspozycji do chorób nowotworowych, monitorowanie i wykrywanie nowotworów

• wykrywanie polimorfizmu sekwencji DNA na potrzeby identyfikacji indywidualnej, ustalanie ojcostwa, identyfikacja sprawców przestępstw

• badania głównego systemu zgodności tkankowej w celu prawidłowego doboru dawców i biorców

Warianty reakcji PCR:

rt-PCR:

proces PCR jest poprzedzany przepisaniem sekwencji mRNA na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji. Jest to technika amplifikacji genów, w której materiałem wyjściowym jest mRNA lub całkowity RNA komórki

Multiplex PCR

Wielomiejscowa reakcja PCR, umożliwia jednoczasową amplifikację kilku fragmentów DNA w mieszaninie reakcyjnej

Nested PCR

Wewnętrzna reakcja PCR: prowadzi się dwie rundy reakcji, do każdej stosuje się dwie pary primerów: zewnętrznych i wewnętrznych, tak że druga para jest umieszczona wewnętrznie w stosunku do pierwszej. Pierwsza runda to standardowe PCR prowadzona przez 15-20 cykli. Mała porcja tak otrzymanej mieszaniny reakcyjnej jest rozcieńczana i poddawana drugiej rundzie amplifikacji przez 15-20 cykli. Poprawia się dzięki temu specyficzność i czułość reakcji PCR

Real time PCR

Tzw „w czasie rzeczywistym”, po każdej replikacji (powieleniu) informuje ile jest kopii DNA

---