Immunologia 6.04.2011

Test elisa - test immunoenzymatyczny

Do wykrywania różnych białek, w tym antygenów lub swoistych przeciwciał w badanym materiale I ich ilościowego oznaczania przy użyciu przeciwciał skoniugowanych z enzymem.

Przykłady

Do oznaczania

1. haptoglobiny, CRP i innych białek oster fazy

2. IgG, igM

3. ACTH

4. Boreliozy - Ab IgG lub IgM przeciw krętkowi

5. Mycoplasma agalactiae (zakażna bezmleczność kóz i owiec - AB

6. BVD (wirusowa biegunka bydła

7. BRSV (bydlęcy syncytialny wirus), AVD(adenowirus), PI3(wirus parainfluenzy)

8. HSV-1, HSV-2 (choroba Aujeszkyego)

IgM w pierwotnej odpowiedzi powstają

Test ELISA wykonuje się na płytkach 96-dołkowych płytkach plastikowych, pipety wielokanałowe, płuczki automatyczne, czytniki do ELISA (spektrofotometryczny pomiar absorbancji)

Zasada oznaczania

-elisa to test kolorymetryczny o wysokiej czułości

-przeciwciała związane z enzymem

-enzym katalizuje przemiane bezbarwnego substratu w barwny produkt

test bezpośredni - wykrywanie antygenu z udziałem 1 przeciwciała związanego z enzymem

Płytkę spłaszczamy lizatem kom lub plynem ustrojowym, w którym poszukujemy antygenu.

Ag+Ab E+ S= odczyt

Test pośredni - biorą udział 2 przeciwciała: 1- pierwszorzędowe, nieznakowane (igG mysie swoiste do wykrywanego białka); 2-drugorzędowe= wtórne, skierowane przeciwko klasie I przeciwciała (np. przeciwko IgG mysim), znakowane enzymem

Ag+Ab+ Antab-E +S = odczyt

Test ELISA do oznaczania przeciwciał:

-immobilizujemy antygen - najczęściej wirusowy

-w surowicy szukamy swoistych przeciwciał przeciwko antygenom wirusowym

Test ELISA kanapkowy - może być bez lub pośredni do wykrywania i ilościowego oznaczania antygenu

Etapy kanapkowego testu ELISA:

1. nalewamy przeciwciała swoiste do antygenu na kilkanaście do kilkudziesięciu godzin aż przeciwciała się przyczepi

2. płukania

3. blokowanie - wysycenie jakimś białkiem na wolne miejsca, kazeina, mleko w proszku na ok. 2h

4. płukanie

5. nałożenie na płytke materiału badanego, w którym poszukujemy antygenu (surowica)

6. jeśli jest w nim poszukiwany antygen dojdzie do połączenia

7. płukanie

8. dodanie przeciwciał związanego z enzymem; jest ono również specyficzne wobec poszukiwanego antygenu, ale rozpoznaje inny region cząsteczki

9. płukanie

10. dodanie roztworu substratu dla enzymu ( enzym katalizuje przemianę bezbarwnego substratu w barwny produkt)

11. odczyt absorbancji

pośredni - pierwszorzędowe nie skoniugowane z enzymem, dopiero drugi

Natężenie barwy - ilość antygenu w badanym preparacie

Próba dodatnia (jest antygen) i ujemna (brak antygenu)

-rozcieńczenie surowicy lub innego materiału badanego

-powtórzenia przynajmniej 2 dołki do każdej próby - wyciąga się z dołków

-przynajmniej 2-3 próbki standardowe do wykreślenia krzywej standardowej

krew bez heparyny i odstawia się na poł godziny w 37stopni i odciąć skrzep, na noc do lodówki i otrzymujemy przesacz.

Enzymy do tworzenia koniugatów: peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna

Substraty dla peroksydazy chrzanowej

-ABTS - niebieskozielony

-TMB - niebieski

-OPD - żółtopomarańczowy

Substraty dla fosfatazy alkalicznej

-PNPP - żółty

test elisa przed szczepieniem i około 2 tygodni po szczepieniu.

Kompetycyjny (rywalizacyjny, konkurencyjny)

Do oznaczania w badanym materiale antygenu

Oznaczany antygen lub przeciwciało muszą być też dostępne w formie oczyszczonej

1.testy z wyłapywaniem antygenu

2. testy z wyłapywaniem przeciwciał

Ad1. przeciwciało na płytce, potem nalewamy antygen znakowany enzymem (nateżenie barwy odwrotnie proporcjonalne do ilośći antygenu)

Mieszanina - materiał badany w którym poszukujemy antygenu + stała ilość antygenu oczyszczonego (np. komercyjnego) znakowanego enzymem

Im wiecej antygenu w materiale badanym t

Ad2. antygen najpierw na płytce

Mieszanina - badany materiał + przeciwciała znakowane enzymem przeciw temu antygenu

Im mniejsze natężenie barwy tym wiecej antygenow w badanym materiale

Im wiecej antygenu w badanym materiale tym mniej znakowanych Ig przyłączy się do antygenu immobilizowanego

Testy konkurencyjne

-Do oznaczania haptenów, które nie maja zdolności do jednoczesnego przyłaczania dwoch przeciwciał- wychwytującego i detekcyjnego

-Hapteny immunogenność zyskuja dopiero po polaczeniu z nośnikiem np. białkiem

-Do oznaczania steż hormonów steroidowych i hormonów tarczycy, obecności leków, używek lub ich metabolitów (kontrola antydopingowa w sporcie)

Znakowanie antygenów i przeciwciał

Fosfataza alkaliczna

Peroksydaza chrzanowa HRP

Enzym - awidyna - przeciwciała biotynylowane, przeciwciała musza mieć biotyne

Awidyna z białka jaja kurzego, pośredniczy w połaczeniu enzymu

RIA (radioimmunolassay)

Zamiast znakowania enzymem - radioizotop, pomiar promieniowania

Bardzo czuły test, drogi

Do oznaczania hormonów i przeciwciał przeciwko alergenom

Test RAST

Do wykrywania IgE przeciwko róznym alergenom

Alergen -nośnik +badana surowica ->

Test ELISPOT

Do wykrywania kom wytwarzających dana cytokinę

Podobny do kanapkowego testu ELISA

Na płytkach dajemy przeciwciała i potem zawiesina komórki np. kom krwi, limf T regulatorowe, następnie do inkubatora to wszystko, jeśli kom produkuja cytokinez to się one przyłączą do przeciwciał, kom wypłukujemy, przeciwciała skoniugowane z enzymem , a barwe otrzymujemy w postaci spotach, jeden spot to jedna komórka.

Cos właśnie pierdoli i nie ogarniam o czym mówi,...

OWD - odczyn wiązania dopełniacza

Stosuje się do identyfikacji i miareczkowania antygenów oraz przeciwciał

Stosowany w diagnostyce zakazen bakteryjnych grzybiczych wirusowych

Podczas testu obserwujemy wystapienie lub nie hemolizy

Etapy

1. inkubacja badanej surowicy, w której poszukujemy swoistych przeciwciał z antygenem +dopełniacz; jeśli doszło do utworzenia kompleksów Ag-Ig to dopełniacz zwiąże się z nimi

2. inaktywacja dopełniacza w 56 stopniach przez Pol godziny

3. dodajemy opłaszczone erytrocyty przeciwciałami - układ wskaźnikowy; jeśli dopełniacz pozostał nie związany w I etapie to będzie on atakował erytrocyty - hemoliza (wynik ujemny)

4. pomiar stopnia hemolizy w spektrofotometrze

Amobceptor - przeciwciała przeciwko erytrocytom, Igs antyerytrocytarne

OWD wykorzystuje się w weterynarii do diagnostyki

Bruceliozy

Gorączki Q

Zarazy stadniczej koni

Nosacizny

Chlamydiozy

Odczyn Wassermana przeciw krętkowi blademu w surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym.

Szybkie testy do wykrywania wirusów w materiale od pacjenta

RSV - syncytialny wirus oddechowy

BRSV - bydlęcy syncytiualny wirus oddechowy

Detekcja wirusowego białka F

Testy immunochromatograficzne

Pokazuje nam testy ciążowe

Jak jeden pasek to jestes zdrowa, jak dwa to jesteś w ciązy jak trzy to masz bliźniaki.

Jak żadnego to jesteśinwalidą

W paśmie kontrolnym - immobilizowany jest antygen

W linii startowej - włóknina nasaczona przeciwciałami, nalewamy antygen, połączenie antygen przeciwciało,

W linii T - jeżeli jest antygen to cos z przeciwciałami ale nie wiem o co chodzi...;/

Odporność swoista, komorkowa, humoralna, prezentacja antygenow, immunosupresja i stymulacja, zapalenie, mediatory zapalne, komórkowe, osoczowe, leki sterydowe i niesterydowe, białka ostrej fazy, ELISA, OWD, ELISPOT

Prectpitacja i aglutynacja w następnym odcinku...

ZAPRASZAM!!

---