wirusologia weterynaryjna

SGGW biologia wieczorowa semestr 4

2011

2011-02-21

1. Metody diagnostyki zakażeń wirusowych

1. Budowa wirusów

Wirion − pojedyncza, kompletna cząstka zakaźna, zdolna do przetrwania poza komórką i zakażenia jej. Składa się z nukleokapsydu złożonego z jednego z dwóch kwasów nukleinowych (DNA lub RNA) otoczonego kapsydem. Nukleokapsyd może być pokryty osłonką (np.: herpeswirusy, wirus grypy) lub pozostawać nagi (np.: adenowirusy, papillomawirusy, wirus mozaiki tytoniu). Osłonka pochodzić może z błony komórkowej komórki gospodarza. Bardziej złożoną budowę ma część wirionów bakteriofagów.

osłonką wirusów ≠ otoczka bakterii

2. wykrywanie

1. bezpośrednie

stwierdzenie wirionów w następstwie izolacji

stwierdzenie antygenów metodami immunofluorestencyjnymi i

stwierdzenie obecności kwasu nukleinowego metodami biologi molekularnej

wykazanie zakaźności w układzie biologicznym:

• zwierzęta doświadczalne

• zarodki ptasie

• hodowla komórkowa

1. pośrednia

wykrywanie przeciwciał

aktywność swoistej odpowiedzi komórkowej

1. izolacja

1. płyny ustrojowe

wirowanie 3tyś obrotów; wiriony obecne w suprenatancie

2. wydaliny i wydzieliny

wytrząsanie z perełkami szklanymi w celu homogenizacji

3*zamrozić(-60°C) i odmrozić w celu uwolnienia wirionów z komórek

wirowanie →zastosowanie antybiotyku → wysiewanie

3. zeskrobiny

4. płyny ze zmian pęcherzowych

5. skrawki śródoperacyjne

6. próbki tkanek post mortem

w moździerzu szklanym lub wytrząsanie z perełkami szklanymi w celu homogenizacji

3*zamrozić lub zniszczyć komórki chemicznie

wirowanie →zastosowanie antybiotyku → wysiewanie

2. namnażanie we wrażliwym układzie biologicznym

komórki permisywne - k. w których możę zajśc pełny cykl życiowy wirusa

1. zwierzęta doświadczalne

małe gryzonie - grypy, wścieklizny, kleszczowego zapalenia mózgu

króliki - wścieklizny, herpeswirusy, pokswirusy

naczelne - odry, różyczki, ?poliomyelitis?

1. drogi wprowadzania

domózgowo - wścieklizna na modelu mysim (ciałka wtrętowe (ciałka Negriego) w komórkach nerwowych;

dootrzewnowo - japońskie zapalenie mózgu (powoduje paraliż kończyn tylnych)

donosowo

dożylnie - w żyłę ogonową

domięśniowo

2. zarodki ptasie

7-11 dniowe zarodki kurze

do jamy owodni

do woreczka żółtkowego

do ciała zarodka

do jamy omoczni

1. objawy

zmiany w wyglądzie: deformacje wybroczyny, przekrwienia

śmierć

ogniska na przydatkach

zmiany właściwości płynu owodniowo oczniowego - na hemaglutynujące

2. hemaglutynacja

Hemaglutynina (w skrócie H lub HA) - glikoproteina o właściwościach antygenowych znajdująca się na powierzchni wirusów. Łączy sie z receptorami erytrocytów. (G. Hirst 1941)

Neuraminidaza (EC 3.2.1.18) - enzym odpowiedzialny za rozkład kwasu sialowego (kwas N-acetyloneuraminowy) występujący w wirusach grypy


zlepiają wirusy: odry, świnki, różycznki, enterowirusy, pokswirusy

odczyny zahamowania hemaglutynacji - test serologiczny w którym wykonuje się szerg rozcieńczen (1:2; 1:4; 1:16 itd) antygenem wzorcowym jest wirus. Wykorzystuje się krwinki barana ocwcy. Durzo przeciwciał - durza kropla krwi - następuje wiązanie.

3. hodowla komórkowa

1. rodzaje hodowli

1. pierwotna

narządy/tkanki od zwierząt

krótkoterminowa - najwyżej kilka pasaży

2. półciągła

diploidalne tkanki płodowe

po 30 - 50 pasażach tracą diploidalność

3. ciągła

brak ograniczeń ilości pasaży

mogą pochodzić z:

tkanek embrionalnych np.: BOLD 3D3 - fibroblasty zarodków mysich

z tkanek nowotworowych - aeuploidalne np. HeLa - linia komórkowa wywodzącą się z komórek raka szyjki macicy, pobranych od 31-letniej Murzynki z Baltimore, Henrietty Lacks zmarłej w 1951 roku.

ze zdrowych dojrzałych tkanek - utraciły diploidalność np. L929 fibroblasty mysie; VERO pochodząca z tkanki nabłonkowej pobranej z nerki afrykańskiego koczkodana zielonego (Chlorocebus aethiops syn. Cercopithecus aethiops)

2. zakładanie hodowli komórkowych

1. W przypadku hodowli pierwotnych (1.4.3.1.1)

narząd (śledzona/węzeł chłonny

przetarcie (straty komórek) lub pocięcie i potraktowanie enzymami: trypsyna z dodatkiem EDTA (halatacja Mg i Ca); łagodniejsze enzymy: kolagenaz4 dyspaza

przygotowanie podłoża

umieszczenie w butelkach

2. w przypadku hodowli ciągłych (1.4.3.1.3) i półciągłych (1.4.3.1.2)

zamówić linie komórkową

wykonać 2 -3 pasaże

cześć komórek zamrozić w ciekłym azocie

umieścić w butelkach

3. podłoża

źródło węgla (glukoza)

witaminy

aminokwasy

wskaźnik pH

monowarstwa (ang. monolayer) - pojedyncza warstwa komórek pokrywających dno pojemnika w którym prowadzona jest chodowla. W takiej warstwie dzielą się komórki znajdujące się z brzegu.

Proliferacja (fr. prolifération od proliférer `mnożyć się przez proliferację' z łac. proles, prolis `potomek, potomstwo' + ferre `nieść') - silne rozrastanie się czegoś, gwałtowny rozwój, rozmnażanie się, bujny rozrost, rozprzestrzenianie się, odradzanie się, możliwość odnawiania się np. komórek różnej populacji

limfocyty rosną w hodowli płynnej, nie przylegają do dna

4. Efekt cytopatyczny CPE (cytopathic effect)

• wartość diagnostyczna

• zmiany degeneracyjne - śmierć komórki

• ciałka wtrętowi w miejscach replikacji wirusa (cytoplazma/jądro)

• powstawanie syncytiów bo zmienia się przepuszczalność błon

• przejaśnienie - łysinka - metoda łysinkowa - rościeńczanie żeby zobaczć jaki obszar niszczy wirion

1. rodzaje łysinek:

• miejscowe

• rozsiane

• syncytialne

hemabsorbcja erytrocytów - wirus wnika do komórki zostawiając na zewnątrz otoczkę. otoczka skleja erytrocyty

1. surowice

płodowa surowica bydlęca

2. płyn hodowlany

podtrzymująca 2-10% surowicy. nie namnaża się

namnażająca - >10% surowicy

4

4

---