ĆWICZENIE 12

/IMMUNODIGNOSTYKA/

Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników

Metody radioimmunologiczne (RIA)

RIA (izotopowe) polegają na wykrywaniu reakcji: antygen-swoiste przeciwciało poprzez pomiar promieniowania izotopów promieniotwórczych związanych z jedną ze składowych reakcji. możliwa jest ocena reakcji: antygen-swoiste przeciwciało poprzez pomiar radioaktywności powstałego kompleksu albo poprzez pomiar radioaktywności supernatantu pozostałego po oddzieleniu utworzonego kompleksu.

Najczęściej do znakowania reagentu (z reguły jest to przeciwciało) stosuje się izotop ¹²⁵J.

RIA charakteryzują się wysoką czułością, oraz mają szerokie zastosowanie praktyczne do ilościowych oznaczeń antygenu lub przeciwciała

Wykorzystanie

-oznaczanuie stężenia w płynach ustrojowych niemal wszystkich hormonów

-wykrywanie obecności białek towarzyszących nowotworom: CEA, AFP

-oznaczanie ilości swoistych przeciwciał klasy IgE

-oznaczanie stężenia witamin, oraz leków

-wykrywanie autoprzeciwciał

C. Metoda immunoradiometryczna (IMRA)

Odczyn jest przeprowadzony w fazie stałej w plastikowych probówkach lub na mikropłytkach. Powierzchnię probówek lub płytek pokrywa się nie znakowanymi przeciwciałami, oraz dodaje badany mareriał, w którym poszukujemy antygenu. Po inkubacji, oraz po odpłukaniu nadmiaru reagenu dodaje się znakowane przeciwciała skierowane przeciwko danemu Ag, wytworzone u innego gatunku niż przeciwciała opłaszczające. Po kolejnej inkubacji, oraz wypłukaniu nie związanych przeciwciał mierzy się radioaktywność związaną z powierzchnią płytki (probówki).

Zastosowanie

-oznaczanie Ag o stosunkowo wysokiej masie cząsteczkowej oraz odpowiedniej liczbie determinant antygenowych

1)-określenie stężenia ferrytyny

2)-oraz niektórych hormonów

W oparciu o IRMA opracowano dwa testy do oznaczania w surowicy poziomu IgE o danej swoistości , oraz całkowitego poziomu IgE

Test RAST (Radioallergosorbent Test)

Test RAST ma zastosowanie do ilościowej oceny stężenia przeciwciał klasy IgE skierowanych przeciwko danemu Ag (alergenowi).Oczyszczony alergen jest wiązany z nośnikiem (krążki bibuły, celuloza, powierzchnia mikropłytek) a następnie inkubowany z badaną surowicą (surowica badana w kolejnych rozcieńczeniach). Po kilkakrotnym odpłukaniu dodaje się przeciwciała anty-IgE, znakowane jodem. Stężenie swoistych przeciwciał IgE w surowicy ocenia się na podstawie pomiaru związanej radioaktywności w kolejnych probówkach w porównaniu z z radioaktywnością w próbach kontrolnych (kolejne rozcieńczenia surowicy kontrolnej o znanym stężeniu przeciwciał IgE o danej swoistości)

Test RIST (Radioimmunosorbent Test)

Test RIST służy do ilościowej oceny poziomu całkowitej IgE w surowicy. Nośnik jest opłaszczony przeciwciałami anty-IgE (króliczymi). Następnie dodaje się kolejne rozcieńczenia badanej surowicy, oraz inkubuje. Równolegle prowadzi się inkubację nośnika opłaszczonego anty-IgE z surowicą wzorcową o znanym stężeniu danych przeciwciał IgE. Po inkubacji dodaje się anty- IgE znakowane jodem

Metoda RIST ma zastosowanie także do ilościowej oceny poziomu IgG w surowicy.W metodzie tej zamiast znakowanych jodem przeciwciał anty IgE dodaje się znakowane jodem białko A (białko A¹²⁵J) mające zdolnośc wiązania się do fragmentu Fc IgG.

Metody immunoenzymatyczne (EIA)

W tych metodach znacznikiem jednego z reagentów (antygenu lub przeciwciała) jest enzym.Produkt reakcji przeprowadzanej przez ten enzym jest barwny, wobec czego można wykryć obecnośc tego produktu metodami spektrofluorymetrycznymi.

Enzymy

-peroksydaza chrzanowa (HRP) ,najczęściej stosowana w praktyce, (dlatego EIA noszą nazwę technik immunoperoksydazowych).

-fosfataza alkaliczna (AP)

-oksydaza glukozowa

Substratami reakcji enzymatycznej są nadtlenek wodoru (H₂O₂) oraz tzw. chromogen, który w reakcji enzymatycznej jest dawcą elektronów.

Nadtlenek wodoru jest redukowany do wody, natomiast chromagen jest przekształcany w barwny związek będący widocznym produktem reakcji

enzym + H₂O₂-enzym x H₂O₂ + chromagen

-barwny produkt reakcji + enzym + H₂O

Wynik reakcji ocenia się metodą spektrofluorometryczną na podstawie pomiaru powstałego w wyniku reakcji enzymatycznej barwnego produktu (przy określonej długości fali). Natężenie zabarwienia jest zależne od ilości powstałego produktu, a ilość wytworzonego produktu wynika bezpośrednio ze stężenia w badanym materiale ocenianego Ag lub przeciwciała.

A. Test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

-jeden z najczęściej stosowanych testów służących do ilościowej oceny w badanym materiale antygenu lub przeciwciała

-jest szybki, oraz może być wykorzystywany w badaniach masowych (gotowe zestawy do przeprowadzania testu)

Zastosowanie

-wykrywanie obecności w płynach biologicznych Ag oraz, przeciwciał w chorobach zakażnych , pasożytniczych

-ilościowa ocena stężenia wielu hormonów

-wykrywanie obecności autoantygenów

Test z reguły wykonuje się na gotowych mikropołytkach z dołkami. Powierzchnię dołków opłaszcza się danym Ag a następnie po odpłukaniu nadmiaru reagentu dodaje się do dołków surowicę, w której poszukujemy przeciwciał, w kolejnych rozcieńczeniach. Po inkubacji (w temp 37 przez godzinę) płytkę przepłukuje się a następnie dodaje przeciwciała wyznakowane enzymem, mające zdolność wiązania się z immunoglobuliną. Po inkubacji płytkę znowu się płucze, a następnie dodaje H₂O₂ , oraz chromogen ( z reguły chromogenem jest OPD (ortofenylenodwuamina). Po odpowiednim czasie reakcję zatrzymuje się dodając kwas solny. Równolegle z przeprowadzonym badaniem wykonuje się próby kontrolne z surowicami ujemnymi (nie zawierającymi poszukiwanego przeciwciała) , oraz kontrolne próby dodatnie (dane przeciwciała w kolejnych znanych rozcieńczeniach - krzywa kalibracyjna). Wynik ocenia się na podstawie natężenia barwy roztworu, (która zależy od ilości wytworzonego barwnego produktu reakcji) mierzonego metodą spektrofluorymetryczną w specjalnie przygotowanym do tego celu czytniku. Przy poszukiwaniu w badanym materiale antygenu powierzchnia dołków jest opłaszczona swoistymi przeciwciałami. Po inkubacji w kolejnych rozcieńczeniach badanego materiału do układu dodaje się przeciwciała homologiczne (tj. o tej samej swoistości co przeciwciała opłaszczające płytkę) wyznakowane enzymem a następnie przeprowadza reakcję enzymatyczną.

Metody fluorometryczne (FIA)

W metodach tych znacznikasmi są fluorochromy.Do znakowania jednego z reagentów (częściej znakuje się przeciwciała, rzadziej cząsteczki Ag) najczęściej stosuje się jeden z barwników fluoroscencyjnych:

-izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) emitujący światło zielone ,lub

-izotiocyjanian rodaminy B (RITC) emitujący światło czerwone

Znakowanie przeciwciał fluorochromem prowadzi się w pH zasadowym w temp

4 C. Wyznakowane przeciwciała należy następnie scharakteryzować, tzn określić ich stężenie, oraz optymalne dla danej reakcji rozcieńczenie.

Emisja fluorescencji jest wzbudzana wiązką światła o małej długości fali przy zastosowaniu filtrów przepuszczających promieniowanie indukujące fluorescencję , oraz filtrów usuwających promieniowanie niepożądane

-reakcja może być przeprowadzona zarówno w środowisku płynnym (tzw metody homogenne)

-jak również w środowisku stałym (tzw mdetody heterogenne)

Metody homogenne

badany materiał jest inkubowany z przeciwciałami wyznakowanymi fluorochromem. Następnie mierzy się za pomocą fluorymetru stopień wygaszania fluorescencji (w stosunku do fluorescencji wyjściowej). Im wyższe było stężenie poszukiwanego Ag w badanej próbie tym silniejsze wygaszanie fluorescencji.

Metody heterogenne

jeden ze składników reakcji jest związany z fazą stałą (np powierzchnia płytki polistyrenowej). Po reakcji opłukuje supernatant, oraz mierzy fluorescencję kompleksu: Ag - przeciwciało związanego z fazą stałą

-metody kompetycyjne

-metody pośrednie

-mwetody kanapkowe

IMMUNOHEMATOLOGIA

Test aglutynacji

• Podstawowa metoda identyfikacji antygenów grupowych i skierowanych przeciwko nim przeciwciał

• Dla typowania grup krwi stosuje się metody serologiczne wykrywania antygenów na powierzchni komórek przy użyciu odpowiednich surowic

• Krwinki posiadające na swojej powierzchni szukany antygen ulegają związaniu przez obecne w surowicy swoiste przeciwciało, powstaje widoczny gołym okiem zlep (aglutynat) krwinek.

• Wystąpienie aglutynacji zależy od liczby i lokalizacji antygenów na powierzchni erytrocytu i stężenia odpowiednich przeciwciał

• Ag układu ABO - około miliona zewnątrzbłonowo

• Ag układu Rh 30-50 tys. cząstek umieszczonych śródbłownowo

• IgM tzw “kompletne aglutyniny” miejsca wiążące Ag oddalone o 30 nm

• IgG tzw “niekompletne aglutyniny” miejsca wiążące Ag oddalone o 14 nm i w standardowych warunkach przeciwciała tej klasy nie mogą połączyć Ag na sąsiednich krwinkach i wywołać aglutynacji.

• ,,Potencjał zeta” - wielkość ładunku na powierzchni erytrocytu, który odpowiada grubości otaczającej krwinkę chmury kationów

Odczyn antyglobulinowy (Coombsa)

• wykrywa obecność przeciwciał niekompletnych, tj. przeciwciał, które wiążą się z antygenami występującymi na powierzchni komórki, ale nie powodują aglutynacji erytrocytów. Przeciwciała niekompletne wykrywa się za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko gammaglobulinie ludzkiej (antyglobulinowych)

Odczyn bezpośredni

• pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych opłaszczonych
  in vivo na erytrocytach

• bezpośrednio do zawiesiny badanych erytrocytów dodaje się przeciwciała antyglobulinowe

Zastosowanie

• wykrywanie na erytrocytach obecności przeciwciał przeciwko antygenowi D układu Rh (choroba hemolityczna noworodków)

• diagnostyka niedokrwistości autoimmunologicznych

Odczyn pośredni

• pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych w surowicy

• w pierwszym etapie odczynu przeprowadzamy opłaszczanie erytrocytów wzorcowych badaną surowicą, a następnie dodajemy do tego układu przeciwciała antyglobulinowe

Zastosowanie

• wykrywanie obecności przeciwciał anty D układu Rh w surowicy matki w przypadku podejrzenia o konflikt serologiczny

• wykrywanie innych przeciwciał niekompletnych w surowicy; np, przeciwko tyreoglobulinie

• wykrywanie obecności w surowicy czynnika reumatoidalnego RF (klasy IgM) w teście Waalera-Rosego.

• wykluczenia obecności w surowicy biorcy przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom dawcy (próba krzyżowa wykonywana przed transfuzją

• określenia fenotypu badanych krwinek przy zastosowaniu przeciwciał o znanej swoistości

• określenia swoistości badanych przeciwciał przy zastosowaniu krwinek o znanym fenotypie

Układ grupowy ABO

• znajdują się na wszystkich komórkach organizmu, za wyjątkiem neuronów

• synteza antygenów układu ABO pozostaje pod kontrolą co najmniej 3 niezależnych loci zawierających jeden z poniższych alleli:

(1) H lub h (2) A₁, A₂, B i O (3) Se i se

• swoistośc antygenu warunkuje cukier zajmujący ostatnią pozycję łańcucha

• istnieją dwie cząstki prekursorowe antygenów ABO, zawierające identyczne reszty cukrowe, różni je wiązanie pomiędzy końcowymi resztami cukrowymi łańcucha

Typ I - wiązanie α(1-3) glikozydowe (pozostałe komórki)

Typ II - wiązanie α(1-4) glikozydowe (erytrocyt)

• Geny warunkujące posiadanie odpowiedniego antygenu grupowego kodują transferazy, przenoszące reszty cukrowe na końcowe miejsce łańcucha prekursorowego

• Antygeny układu ABO pojawiają się w 6 tygodniu życia płodowego, jednak do ich pełnej ekspresji dochodzi w 6-18 miesięcy po urodzeniu.

• Antygeny układu ABO posiadają szereg odmian, najważniejsze (A₁ i A₂)

• Osobnicy określani fenotypowo jako A₂, posiadają czterokrotnie mniej determinant antygenowych na powierzchni erytrocytu niż A₁ , gdyż ich transferaza posiada mniejszą aktywność i wydaje się, że przenosi reszty N-acetylogalaktozaminy tylko na pewne warianty typu II łańcucha H.

• Większość noworodków wykazuje po urodzeniu fenotyp A₂ , ponieważ pełną aktywność transferaza uzyskuje dopiero po kilku miesiącach życia.

• Pozostałe odmiany antygenu A (A₃, A_end, A_m, A_x, A_y, A_el) występują u mniej niż 1% osób A dodatnich.

Przeciwciała układu ABO

• Lanstainer (laureat nagrody Nobla, po raz pierwszy opisał układ grupowy ABO w 1909 roku) stwierdził, że w surowicy ,,naturalnie” występują przeciwciała skierowane przeciwko antygenom układu ABO nieobecnym na krwinkach.

• Według Landstainera przeciwciała ,,naturalne'', w przeciwieństwie do ,,odpornościowych”, powstają bez uprzedniego kontaktu z antygenem, dzięki stymulacji powszechnie występującymi w przyrodzie substancjami grupowymi. Cząstki krzyżowo reagujące z antygenami układu ABO znaleziono na komórkach bakterii, roślin (pyłki) i zwierząt. Na rolę bakterii wskazują przypadki braku przeciwciał anty-A i anty-B u osobników utrzymywanych w sterylnym otoczeniu (germ-free).

• W celu określenia grupy krwi należy u badanego przeprowadzić zarówno reakcję aglutynacji jego krwinek z surowicami wzorcowymi (anty A i anty B), jak i pomiędzy jego surowicą a wzorcowymi krwinkami grupy A i B.

• Przeciwciała ,,naturalne'' należą najczęściej do klasy IgM (niewielka ilość klasy IgG i/lub IgA), nie przechodzą przez łożysko i nie aktywują układu dopełniacza. Produkcja przeciwciał rozpoczyna się bezpośrednio po urodzeniu, jednak do 3-6 miesiąca życia ich miano jest zbyt niskie, aby mogło zostać wykryte, największe stężenie obserwuje się pomiędzy 5-10 rokiem życia, następnie ich miano stopniowo obniża się, tak że u osób w podeszłym wieku może być zbyt niskie aby wywołać aglutynację.

Układ grupowy Rh

• Fisher i Race zaproponowali istnienie 3 blisko leżących loci , które kodują białka tworzące antygeny układu Rh. W każdym z loci znajduje się jeden z pary alleli: D/d, C/c, E,e.

• Antygeny Rh pojawiają się w 6 tygodniu życia płodowego i w organizmie znajdują się wyłącznie na erytrocytach. Od okresu płodowego wykazują wysoką immunogenność, najsilniej syntezę przeciwciał pobudza antygen D.

• Osobników posiadających na powierzchni erytrocytów antygen D przyjęto nazywać Rh dodatnich, bez względu na inne towarzyszące antygeny Rh.

• Przeciwciała anty Rh powstają w wyniku uczulenia w okresie ciąży, lub po przetoczeniu krwi niezgodnej w układzie Rh.

---