MIKROBIOLOGIA laboratorium 14 Różnicowanie pałeczek jelitowych, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 2, mikrobiologia


Temat 14: Różnicowanie pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae

Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

Enterobacteriaceae (z gr. enteron - jelito) tworzą obszerną rodzinę pałeczek występujących głównie w jelicie człowieka i zwierząt. Z tego powodu często określa się je mianem pałeczek jelitowych. Są to średniej wielkości gramujemne pałeczki, nieprzetrwalnikujące, ruchliwe lub nieruchliwe, posiadające otoczki lub bezotoczkowe, rosnące na zwykłych podłożach. Ich wspólnymi cechami biochemicznymi są:

Prawie wszystkie pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzają katalazę (enzym rozkładający H2O2). W kwasie DNA tych bakterii suma cząsteczek guaniny i cytozyny (G+C) wynosi 39-59%. Granice między poszczególnymi rodzajami nie są ostre, spotyka się liczne formy przejściowe. Dlatego klasyfikacja tej rodziny nie jest jeszcze ostatecznie ustalona.

Zgodnie z klasyfikacją podaną przez Bergeys Manual of Determinative Bacteriology rodzinę Enterobacteriaceae dzielimy na 5 trybów:

Tryb I - Escherichieae - obejmuje rodzaje: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter,

Salmonella, Shigiella

Tryb II - Klebsielleae - obejmuje rodzaje: Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia

Tryb III - Proteae - obejmuje rodzaj Proteus

Tryb IV -Yersinieae - obejmuje rodzaj Yersinia

Tryb V - Erwinieae - obejmuje rodzaj Erwinia.

Podział na tryby oparto głównie na podobieństwie składu DNA, które jest wyrazem pokrewieństwa mikroorganizmów.

Część pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae powoduje zakażenia przewodu pokarmowego (Shigella wywołująca czerwonkę, czy Salmonella powodująca dur brzuszny lub tzw. salmonellozy, czyli zatrucia pokarmowe), inne zaliczamy do względnie chorobotwórczych lub komensali (mikroorganizmów w zasadzie niechorobotwórczych, które zazwyczaj współżyją z organizmem gospodarza). Jednak przeniknięcie niektórych komensali do miejsc w organizmie, w których normalnie nie występują, może stać się przyczyną niebezpiecznych zakażeń. Szczepy Klebsiella pneumonieae, Escherichia coli (pałeczki okrężnicy), Proteus sp. i inne, mogą spowodować trudne do wyleczenia zakażenia dróg moczowych, oddechowych, posocznice u wcześniaków i noworodków.

Jako że dla większości pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae naturalnym miejscem bytowania jest przewód pokarmowy człowieka i zwierząt, ich obecność w innych miejscach, np. w wodzie, glebie, czy w produktach żywnościowych traktowana jest jako wskaźnik bezpośredniego lub pośredniego zanieczyszczenia fekalnego (kałowego). Przykładem może tu być szerokie stosowanie pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) w ocenie stanu sanitarnego wody.

Pałeczki Enterobacteriaceae, poza nielicznymi wyjątkami, nie wykazują większych różnic morfologicznych komórek lub kolonii, umożliwiających odróżnienie rodzajów i gatunków. Różnicowanie w ich obrębie oparte jest głównie na określeniu właściwości biochemicznych badanego szczepu. Analizie takiej poddaje się szczepy bakterii wyizolowane z badanego materiału na podłożach wybiórczo-namnażających (SF, Levin, Mc Conkey, SS, Wilson - Blair). Kryterium zaliczenia pałeczek do określonego rodzaju stanowi zespół właściwości biochemicznych, takich jak:

Diagnostykę bakterii z rodziny Enterobacteriaceae poprzedza wykonanie oznaczeń potwierdzających zdolność wyizolowanych szczepów do:

Następnie należy przystąpić do bezpośredniej identyfikacji bakterii do rodzaju i gatunku, na podstawie schematów biochemicznych. Badania przeprowadza się etapami.

Pierwszy z nich polega na wykonaniu tzw. szeregu izolacyjnego. Składa się on z czterech podłoży diagnostycznych:

  1. wody peptonowej z tryptofanem,

  2. podłoża Kliglera,

  3. laktozy 10% pod parafiną,

  4. podłoża z mocznikiem.

Wzrost bakterii na tych podłożach pozwala na ocenę następujących właściwości:

  1. wytwarzania indolu z tryptofanu,

  2. zdolności do wytwarzania siarkowodoru (H2S),

  3. wytwarzania gazu przy fermentacji węglowodanów,

  4. rozkładu laktozy i mocznika.

Wyniki tych badań są podstawą do zastosowania odpowiedniego szeregu różnicującego w drugim etapie badań.

Etap trzeci, tzw. testy potwierdzające, wykonywany jest tylko w przypadkach wątpliwych, w których nie jest możliwe określenie przynależności taksonomicznej badanego szczepu na podstawie uprzednio przeprowadzonych badań.

Klasyczna diagnostyka drobnoustrojów wymaga zgromadzenia bardzo wielu danych. Jest to praca żmudna, długotrwała i wymagająca zastosowania wielu podłóż i odczynników. Jest to więc badanie drogie. Dlatego w praktyce stosuje się szereg mikrometod ułatwiających i przyśpieszających identyfikację. Metody takie zostały m.in. opracowane dla bakterii będących wskaźnikami stanu sanitarnego, np. szybka identyfikacja pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) spośród bakterii grupy coli typu kałowego możliwa jest dzięki tzw. testowi (szeregowi) IMVC. Skrót ten oznacza następujące cztery badania:

zabarwienie przy zakwaszeniu podłoża Clarca w wyniku rozkładu glukozy,

na podłożu Clarca (tzw. reakcja Vogesa-Proskauera),

Typowe szczepy Escherichia coli wytwarzają indol z tryptofanu, rozkładają glukozę z wytworzeniem kwasu, nie wytwarzają acetylometylokarbinolu i nie potrafią korzystać z cytrynianu jako jedynego źródła węgla, a więc w teście IMVC dają wynik: ++ . Wyjątkowo zdarzają się szczepy E. coli indoloujemne i w tedy wynik szeregu IMVC będzie miał postać: − + − −. Według szeregu IMVC identyfikuje się w sposób pewny tylko te bakterie z grupy coli, u których wcześniej stwierdzono, że fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w temperaturze 440C.

Ważną rolę w badaniach taksonomicznych odgrywa szybkość oznaczenia właściwości biochemicznych drobnoustrojów. Powoduje to tendencję do maksymalnego upraszczania i ograniczania czynności w trakcie diagnostyki. Przykładem tych uproszczeń może być zestaw podłoży Pathotec paper strips oraz Enterotube. Zestaw Pathotec zawiera paski bibuły nasycone odpowiednimi reagentami. Użycie ich pozwala w ciągu kilku godzin oznaczyć takie właściwości szczepu, jak: redukcja azotanów, deaminacja fenyloalaniny, wytwarzanie ureazy, siarkowodoru, dekarboksylacja lizyny, rozkładanie malonianu sodowego i eskuliny.

Zestaw Enterotube zawiera w jednej plastikowej probówce (ang. tube - rurka, probówka) 8 podłoży pozwalających na jednoczesne określenie 11 cech biochemicznych: rozkład glukozy do kwasu i gazu, rozkład laktozy, dulcytolu, deaminacja fenyloalaniny, dekarboksylacja lizyny i ornityny, wytwarzanie siarkowodoru, indolu, rozkład mocznika oraz zdolność wykorzystania cytrynianu jako jedynego źródła węgla. Dodatkową zaletą omawianego zestawu jest łatwość i szybkość posiewu (jednorazowe przeciągnięcie ezy przez wszystkie podłoża) oraz możliwość odczytania wyników nawet przez pomocniczy personel, w oparciu o zamieszczone schematy barwne.

W Polsce produkowany jest zestaw pod nazwą Enteroplast. Są to plastikowe płytki ze studzienkami zawierającymi bezwodne podłoża z substratami różnicującymi. Pozwalają one na oznaczenie 10 cech biochemicznych na podstawie pojawienia się określonego zabarwienia podłoża. Do studzienek wprowadza się zawiesinę badanego szczepu bakterii i poddaje inkubacji w temp. 370C przez 24 godz. W studzienkach bada się następujące reakcje:

Na podstawie uzyskanych reakcji barwnych określa się rodzaj bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, korzystając z dołączonych tabel.

Oznaczanie podstawowych cech biochemicznych w tego typu testach pozwala tylko na przybliżoną identyfikację szczepu. Precyzyjne określenie przynależności gatunkowej możliwe jest dopiero po rozszerzonym badaniu biochemicznym i serologicznym (z zastosowaniem specyficznych przeciwciał).

Część praktyczna

Zadanie: Identyfikacja gatunków pałeczek jelitowych na podstawie wybranych testów

biochemicznych

Określić gatunek (rodzaj) badanej bakterii korzystając z tabel identyfikacyjnych, na podstawie wyników reakcji Vogesa-Proskauera, odczynu MR, próby na indol i obserwacji wzrostu bakterii na wybranych pożywkach (podłoża z: cytrynianem sodu, laktozą i z mocznikiem)



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Mikrobiologia - wydaje się być wszystko, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 2, mikrobiolog
Mikrobiologia - pytania z egzaminu, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 2, mikrobiologia
Kolokwia-wszystkie, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 2, mikrobiologia
Higiena Produkcji - pytania z Zywienia-Diet. - sesja zima200, żywienie człowieka i ocena żywności, s
woda jako składnik żywności oraz równowagi kwasowo- zasadowe w żywności, żywienie człowieka i ocena
pytaniahigienaaa, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 4, higiena
Zadanie 9, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 1, matematyka
FIZJOLOGIA PYTANIA I TERMIN 2014 dzienne grupa A, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 4, fi
sprawozdanie z genetyki 11, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 4, genetyka
Organizacja wykladen, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 2, organizacja przed
Gary sciaga2, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 4, technologia gastronomiczna
sciaga9 hig, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 4, higiena
Warunki zaliczenia przedmiotu, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 4, genetyka
Przykładowe zadania z matematyki, żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 1, matematyka
pytania egzamin(1), żywienie człowieka i ocena żywności, semestr 3, analiza żywności

więcej podobnych podstron