Cwiczenie 1, Uczelnia, genetyka, genetyka


Zakładanie makrohodowli

Hodowlę komórkową zakładamy w sterylnym jednorazowym naczyniu hodowlanym NUNC o pojemności 25ml w warunkach jałowych (komora laminarna)

a)do sterylnej probówki z 1 ml heparyny (50 IU/ 1ml krwi) pobieramy 10 ml krwi żylnej. Odstawiamy do sedymentacji na około 2h w temperaturze pokojowej

b)osad białych krwinek wraz z 1 ml osocza przenosimy do naczynia hodowlanego z 8ml płynu hodowlanego oraz 1ml surowicy płodowej cielęcej. Naczynie należy szczelnie zamknąć, krańcowa objętość hodowli wynosi 10ml

c)umieścić naczynie hodowlane w cieplarce o temperaturze 37C na okres 48-72h, każdego dnia hodowlę mieszamy

d)na 2h przed zakończeniem hodowlę wyjmujemy z cieplarki, dodajemy colcemidu
0,15 μg/ml i wstawiamy ponownie do cieplarki na 2h

  1. Wykańczanie hodowli:

a)zawartość hodowli przenosimy do wirówki - 7min, 800obr/min

b)zlewamy płyn znad osadu, probówkę wstrząsamy, kroplami dodajemy 10ml 0,075M KCl (0,55%), na 17min w temperaturze pokojowej, wirujemy 7 min, 800obr/min

c)zlewamy płyn znad osadu, do osadu dodajemy 10ml płynu Carnoy'a (mieszanina metanolu i kwasu octowego lodowego w stosunku 3:1). Probówkę umieszczamy na 10 min w lodówce. Wirujemy 3 razy po 7 min, 800obr/min

d)po zlaniu płynu znad osadu osad nanosimy na oziębione szkiełka podstawowe

e)po wysuszeniu barwimy preparat barwnikiem Giemsy

Mikrohodowla - zakładanie

Mikrohodowla jest stosowana powszechnie w rutynowej diagnostyce noworodków i małych dzieci.

a)Wysterylizowane buteleczki po penicylinie o pojemności 5ml lub w naczyniach plastykowych

b)Do 2ml płynu dodajemy 4 krople (0,3-0,5ml) pełnej krwi obwodowej (pobranej z pięty lub żyły ciemieniowej)

c)Hodowla 72h, z zachowaniem tych samych procedur co w makrohodowli

Hodowla chromosomów z komórek szpiku ludzkiego

Bioptat szpiku (1-2ml) należy umieścić natychmiast po pobraniu w jałowej probówce z ogrzanym do 37C płynem hodowlanym (np. RPMI 1640) z dodatkiem 15% płodowej surowicy cielęcej oraz antybiotykami (penicylina, streptomycyna) w standardowych stężeniach. Dodatkowo należy dodać heparynę 250 IU/ml

Dwie drogi postępowania:

a)metoda uzyskiwania chromosomów bezpośrednio po pobraniu

b)metoda krótkotrwałej hodowli

a) metoda uzyskiwania chromosomów bezpośrednio po pobraniu

Polega na inkubacji komórek szpiku przez 1-2h w pożywce z colcemidem (25μg/ml). Jest zalecanym postępowaniem w przypadkach ostrych białaczek szpikowych i limfatycznych

b)metoda krótkotrwałej hodowli

hodowlę komórek zakładamy w w/w płynie hodowlanym stosując rozcieńczenie komórek szpiku kostnego - milion/ml hodowli. Komórki hoduje się przez 24-48h w temperaturze 37C, w atmosferze z 5% CO2.

Dalsze etapy utrwalania i wykańczania podobne jak w standardowych technikach cytogenetycznych.

W przypadkach białaczek, gdy komórki nowotworowe występują we krwi obwodowej stosuje się 24-48h niestymulowaną mitogenami hodowlę komórek pobranych drogą nakłucia żylnego.

Zasady barwienia takie same jak chromosomów z innych tkanek.

Hodowla chromosomów z tkanek pochodzących z guzów nowotworowych

Transport guza:

Przygotowanie tkanek guza:

Skład płynu hodowlanego (100ml)

Przenoszenie tkanek guza do naczynia hodowlanego NUNC, w którym znajduje się 5ml płynu hodowlanego, 1ml kolagenazy o stężeniu 150-200 IU/ml. Całość trzymamy w cieplarce (37C, 24h, 5%CO2)

Zakładanie hodowli: naczynie szklane 8,5ml płynu hodowlanego, 1,5ml zawiesiny komórek guza, naczynie plastykowe 4,5ml płynu hodowlanego 0,5ml zawiesiny komórek guza

Hodowla w temperaturze 37C, z przepływem 5%CO2. Codziennie oglądamy w mikroskopie odwróconym wzrost kolonii.

UWAGA!: co 2-3 dni zmiana płynu hodowlanego

Zakończenie hodowli

Przeprowadzenie szoku hipotonicznego:

Skład płynu hipotonicznego:KCL, HEPES, EGTA, WODA,Ph

Szok hipotoniczny przeprowadzamy w temperaturze 37st.C przez 45min. Następnie wirujemy 10min 1100obr/min

Utrwalanie materiału komórkowego

Dodatkowe czynności, które mogą być wykonane w czasie prowadzenia hodowli:

a)przy szybkim wzrosćie komórek (możliwość zahamowania wzrostu komórek) - możliwość pasażowania przy użyciu roztworu trypsyny (otrzymujemy 2 hodowle z jednej)

b)przy braku przyczepu komórek do ścian naczynia zakładamy ponownie hodowlę w naczyniach z kolagenem

c)nadmiar erytrocytów - płuczemy hodowlę w płynie niszczącym erytrocyty(NH4Cl, NaHCO3, EDTA)przez 15min w autoklawie

Wybarwienie prążków G w chromosomach metafazowych:

1)Do barwienia na prążki G używamy preparatów chromosomowych świeżych (4-10dni)

2)preparaty poddajemy trawieniu roztworem trypsyny o stężeniu 0,25%-0,5% w buforze Sorensena o pH 6,8

Odczynniki:

Wykonanie:

1)roztwór trawiący: pobrać 50ml roztworu wyjściowego trypsyny, dodać 30ml PBS, przelać do naczynia do barwienia

2)zanurzyć preparat w roztworze trawiącym na około 8-10s

3)płukać preparat kilkakrotnie w roztworze PBS

4)barwić 4-6x 3,5% roztworem Giemsy w buforze Sorensena o pH 6,8

5)płukać 3x w wodzie destylowanej

6)preparaty oceniać w mikroskopie świetlnym

CEL: rutynowe barwienie, ocena kariotypu

Wybarwianie prążków Q w chromosomach metafazowych:

Odczynniki:

a)roztwór wyjściowy barwnika fluorescencyjnego np. atebryny (rozpuszczonej w buforze Sorensena o pH 6,0)

Wykonanie:

a)barwić szkiełka w roztworze atebryny przez 5-10 min w temperaturze pokojowej,

b)płukać w buforze Sorensena o pH 6,0

c)pozostawić preparaty na 5min w nowej zmianie buforu Sorensena o pH 6,0

d)zamknąć preparaty w mieszaninie glicerolu i buforu McKraine'a o pH 7,0 (mieszanina kw. Cytrynowego z wodorofosforanem dwusodowym)

e)preparaty oceniać bezpośrednio pod mikroskopem fluorescencyjnym i odpowiednimi filtrami

Wybarwianie prążków C

Uzyskanie prążków C wymaga usunięcia z chromosomu pewnych ilości DNA przy zastosowaniu wodorotlenku baru.

Wykonanie:

a)preparaty chromosomowe inkubować 1h w roztworze 0,1N HCl, w temperaturze pokojowej

b)opłukać w wodzie destylowanej

c)następnie preparaty inkubować przez 5-15min w świeżo przygotowanym 5% wodnym roztworze Ba(OH)2 x8H2O w temperaturze 50C,

d)opłukać w kilku zmianach wody destylowanej

e)inkubować 1h w 2xSSC o temperaturze 60C

f)opłukać krótko wodą destylowaną

g0preparaty przed barwieniem przepłukać 0,1N HCl

h)barwić barwnikiem Giemsy 2% w buforze Sorensena o pH 6,8

i)opłukać krótko wodą destylowaną i osuszyć preparaty bibułą

j)przeprowadzić przez szereg alkoholowy 20%, 80%

prążki C wybarwiają się barwnikiem Giemsy w okolicy heterochromatyny centromerowej i przewężeń wtórnych oraz dystalnych części ramion długich chromosomu Y

wybarwienie rejonów jąderko twórczych w chromosomach metafazowych (AgNOR)

a)preparaty pokryć roztworem 50% AgNO3 i nałożyć szkiełko przykrywkowe

b)umieścić szkiełko w szczelnym naczyniu spełniającym rolę wilgotnej komory

c)preparaty inkubować przez 18h w temperaturze 37C lub przez 2-5h w temperaturze 50C

d)przebieg reakcji wysrebrzania oceniać pod mikroskopem kontrastowo-fazowym, w razie potrzeby można wydłużyć czas inkubacji

e0preparaty podbarwić 3% roztworem Giemsy i oceniać pod mikroskopem świetlnym

f)modyfikacja: można użyć amoniakalnego roztworu azotanu srebra i 3% formaliny



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Linkage cwiczenia, 4 ROK, GENETYKA, GIEŁDY
Kolokwia,egzaminy, Dzienni07, Wyniki z zaliczenia ćwiczeń i wykładów z Genetyki i hodowli roślin ogr
ENG Linkage cwiczenia, 4 ROK, GENETYKA, GIEŁDY
tematy ćwiczeń z biologii z genetyką, bilogia z genetyką
Ćwiczenie 7 Algoryty genetyczne, Dydaktyka, MPD, Tematy ćwiczeń
ĆWICZENIE II â GENETYKA
GENETYKA cwiczenia, STUDIA, Genetyka
makro-do-cwiczen, uczelnia WSEI Lublin, UCZELNIA WSEI 2, MAKRO
Zarządzanie jakością ćwiczenia, Uczelnia, Zarządzanie jakością
Ćwiczenie 3 2, Uczelnia, imunny
Ćwiczenie 6, uczelnia, BL, Geodezja, ćwiczenia
Ćwiczenie 6(1), Uczelnia, imunny
Ćwiczenie 1(1), Uczelnia, imunny
Ćwiczenie 5, uczelnia, BL, Geodezja, ćwiczenia
Koncepcje zarządania ćwiczenia, UCZELNIA, AE Katowice
INSTRUKCJA DO ĆWICZENIA, UCZELNIA, SEMESTR 4, FIZYKA BUDOWLI, Labolatoria, 1
MUZYKOTERAPIA GR.O NOWE ĆWICZENIA, ^v^ UCZELNIA ^v^, ^v^ Pedagogika, promocja zdrowia z arteterapią

więcej podobnych podstron