ENZYMY EKSKRECYJNE

Wzrost ich aktywności w surowicy krwi obserwuje się wskutek przeszkody w normalnym odpływie różnych wydzielin ustrojowych tj. żółć, sok trzustkowy, ciecz sterczowa czy ślina. W wyniku istnienia przeszkody w drogach odprowadzających wydzieliny dochodzi do jej zastoju, co doprowadza do przejścia enzymów do krwiobiegu. Należą tu enzymy soku trzustkowego (amylaza, lipaza, RNAza, DNAza), żółci (fosfataza zasadowa, y-glutamylotranspeptydaza, aminopeptydaza leucynowa) oraz fosfataza kwasowa cieczy. Stosunkowo najlepiej rozwinęła się diagnostyka enzymologiczna schorzeń mięśnia sercowego, wątroby, trzustki, czy żołądka.

Enzymy restrykcyjne

Dzięki rekombinacyjnej technologii DNA izolowanie, badanie, dowolne zmiany genów stały się obecnie powszechne. Niezwykle duży postęp dokonany w dziedzinie zrozumienia struktury i funkcji genów oraz praktycznych zastosowań tej wiedzy rozpoczął się w rezultacie opracowania kilku podstawowych metod ­najważniejsze- sposób rozcinania DNA w specyficznych miejscach, za pomocą restrykcyjnych endonukleaz (enzymów restrykcyjnych) umożliwiające otrzymanie z dużą dokładnością specyficznych sekwencji DNA, hybrydyzację kwasów nukleinowych, metody uzyskiwania specyficznych DNA w dużych ilościach, klonowanie DNA szybkie sekwencjonowanie DNA umożliwiające określenie sekwencji nukleotydów w izolowanych genach i kontrolowanych rejonach DNA. Rewolucje w dziedzinie biologii molekularnej spowodowało opracowanie łańcuchowej reakcji polimeryzacji PCR.

Trawienie enzymami restrykcyjny mi:

- enzymy restrykcyjne rozpoznają w 2-niciowym DNA specyficzne sekwencje nukleotydowe, miejsca restrykcyjne zwykle o długości 4,5,6 nukleotydów i rozcinają obydwie nici DNA przy określonych miejscach znajdujących się w obrębie rozpoznanych sekwencji. Istnieją 3 różne sposoby rozcinania DNA: -nierównomierne rozcinanie na ukos pozostawiające niesmarowany koniec 5' (tzn na końcu 5' powstaje krótki jednoniciowy odcinek wysunięty przed koniec 3' regionu 2-niciowego)

- nierównomierne rozcinanie pozostawiające niesparowany koniec 3' lub rozcięte w tym samym miejscu z utworzeniem tępych końców rozciętego DNA (rys1)

Końce DNA powstające przy rozcinaniu na ukos są nazywane końcami kohezyjnymi lub lepkimi, ponieważ umożliwiają dwóm dowolnym fragmentom DNA uzyskanym z cięcia tym samym enzymem restrykcyjnym utworzenie komplementarnej pary zasad. Końce takie mogą być następnie połączone kowalencyjnie przez enzym ligazę DNA. Łączenie frag. DNA za pomocą ligazy DNA jest określane jako ligacja. Nowa cząst. DNA utworzona przez połączenie frag. DNA nazywamy cząsteczką zrekombinowanego DNA (rys. 2). Cząsteczki o tępych końcach także można łączyć za pomocą ligazy ale reakcja ta przebiega trudniej niż w przypadku łączenia fragmentów o końcach kohezyjnych.

Nazewnictwo

Enzymy restrykcyjne izoluje się z bakterii gdzie ich rola polega na ochronie komórki gospodarza przed infekcją wirusową. Dotychczas wyizolowano 100 enzymów restrykcyjnych. Ich trójwymiarowe nazwy pochodzą od nazwy gatunku bakterii, z których zostały wyizolowane. Pierwsza litera nazwy enzymu pochodzi od pierwszej litery nazwy rodzaju bakterii a następne dwie od nazwy gatunku. Ponieważ każda bakteria może zawierać kilka rodzajów różnych enzymów restrykcyjnych każdy z nich jest dodatkowo oznaczony cyfrą rzymska.

Elektroforeza żelowa:

Fragmenty DNA nazywane fragmentami restrykcyjnymi powstają po rozcięciu cząsteczki DNA enzymem restrykcyjnym można rozdzielić metodą elektroforezy żelowej (rys.3). Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym umożliwia podział małych fragmentów o długości poniżej 500 par zasad. Do rozdziału większych fragmentów jest potrzebny żel agarozowy ( o większych porach niż żel poliakrylamidowy). Produkty trawienia DNA rozdziela się na serią prążków będących fragmentami DNA. Ponieważ Male fragmenty DNA migrują dalej niż fragmenty większe, dlatego wielkość każdego z nich można oszacować na podstawie drogi migracji w porównaniu ze standardową mieszaniną fragmentów o znanej wielkości. Po elektroforezie DNA można uwidocznić w żelu przez wybarwienie go bromkiem etydyny, który wiąże się z DNA i silnie fluoryzuje emitując jasne pomarańczowe światło alternatywnie, jeżeli DNA było znakowane radioizotopem takim jak B2D frag. Restrykcyjne można zlokalizować. W żelu nakładając na niego filtr radioaktywny. Radioaktywność zawarta w pasmach DNA powoduje rozkład związków srebra w emulsji, prowadząc do powstania ciemnych plam w miejscach odpowiadających radioaktywnym prążkom(radioautografia). Elektroforeza fragmentów DNA w żelu agarozowym. Fragmenty Dna o znanej wielkości poddano elektroforezie w ścieżce 1( ich wielkość w pz podano po stronie lewej). Restrykcyjny hydrolizat próbki DNA migrował w ścieżce 2. Porównując drogę migracji tych fragmentów z drogą migracji fragmentów można określić, że fragmenty restrykcyjne mają wielkość ok. 8000, 2000 pz.

Mapy restrykcyjne

Dwuniciowy DNA może być rozcięty przez enzymy restrykcyjne rozpoznające rożne sekwencje. Rozdzielając fragmenty restrykcyjne i określając wielkość za pomocą elektroforezy żelowej można wydedukować w jakich miejscach cząsteczka DNA ulega rozcięciu. Na tej podstawie można sporządzić mapę restrykcyjną pokazującą lokalizację miejsc rozcięcia (miejsc restrykcyjnych).

Typowa mapa restrykcyjna cząsteczki DNA. Miejsce rozcinania DNA przez rożne enzymy restrykcyjne zaznaczono literami.

Mapy restrykcyjne umożliwiają porównanie 2 cząsteczek DNA podczas badania ewolucyjnego pokrewieństwa między gatunkami bez konieczności określania sekwencji nukleotydowej każdej z tych cząstek. Mapy restrykcyjne są tez używane podczas eksperymentów prowadzonych rekombinacji DNA, zarówno do planowania miejsc w których konkretna cząsteczka DNA powinna być rozcięta jak i do śledzenia przebiegu eksperymentu.

Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

Analiza genomowa człowieka udowodniła, że DNA poszczegó1nych osób ,wykazuje w sekwencjach wiele różnic nie wywołujących widocznych efektów, często dlatego ze różnice te występują w obrębie intronów lub na odcinkach między genami. Niektóre z tych zmian bardzo powszechnie występują u poszczególnych osób w populacji, międzyosobnicze różnice nazywamy polimorfizmem. Niektóre rodzaje polimorfizmu, wpływają na wielkość frag. restrykcyjnych uzyskiwanych przy stosowaniu określonego enzymu restrykcyjnego, np. gdy wskutek zaistniałej zmiany jakiegoś nukleozydu w miejscu rozpoznawalnym przez jakieś restryktazy nastąpi eliminacja określonego miejsca rozcinania DNA. Zamiast więc 2 fragmentów restrykcyjnych pochodzących z tego rejonu powstaje jeden duży fragment. Alternatywnie polimorfizm może wynikać z insercji lub delecji pewnych sekwencji zawartych między dwoma miejscami rozcinania w wyniku czego zwiększa się lub zmniejsza wielkość powstających fragmentów. Taki rodzaj polimorfizmu, który wpływa na wielkość fragmentów restrykcyjnych jest określany jako polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). RFLP można wykryć hybrydyzacyjną metodą Southema pod warunkiem dysponowania sondą molekularną w postaci odczynnika DNA o sekwencji komplementarnej do sekwencji restrykcyjnej zawierające miejsca decydujące o polimorfizmie.

Enzymatyczne frakcjonowanie jąder komórkowych

Realizacja informacji zawartej w jądrze komórkowym odbywa się przez proces transkrypcji. Transkrybowane sekwencje DNA stanowią od 1- 20% całego genomu. Wydaje się że zmiany w strukturze prowadzące do rozluźnienia włókna chromatynowego są jednym z mechanizmów kontrolującym aktywność genów. Zmieniona konformacja aktywnych regionów chromatyny przejawia się zwiększoną podatnością na nukleazy: DNA-azc I, DNA-aze II czy nukleazę mikropokalne pozwala w warunkach ograniczonego trawienia wydzielić z chromatyny frakcję wrażliwą na nukleazy oraz oporną na nukleazy (różniące się aktywnością transkrypcyjną).

Frakcjonowanie jąder komórkowych za pomocą DNA-azy I

Aktywna transkrypcyjnie chromatyna występuje w konformacji charakteryzującej się zwiększoną podatnością na DNA-azę I. DNA -aza I jest endonukleazą hydrolizującą wiązanie 3' -5' fosodiestrowe jednoniciowego lub dwuniciowego DNA preferencyjnie przy nukleotydach pirymidynowych. Do poli i oligodeoksyrybonukleotydów z resztą fosforanową na końcu 5' i wolna grupą hydroksylową na końcu 3'. Aktywatorami DNA-azy I są jony dwuwartościowe Mg, Ca , a inhibitorami czynniki chelatujące jak EDTA. Wrażliwość chromatyny na DNA-azę I jest tkankowo specyficzna, przy czym trawione są zarówno geny aktywne jak i potencjalnie aktywne co ukazuje, ze zmienna konformacja jest charakterystyczna dla wszystkich genów ulegających ekspansji w danym typie komórek niezależnie od etapu , ich zróżnicowania i rozwoju. Obszar większej podatności na DNA-azę I nie ogranicza się do samych genów ale obejmuje regiony regulatorowe po stronic 5' i :r genu.

Frakcjonowanie jąder komórkowych za pomocą nukleazy mikropokalnej

Chromatyna aktywna transkrypcyjnie występuje w konformacji charakteryzującej się zwiększoną podatnością na trawienie nukleazą mikropokalną. Nukleaza ta jest zewnątrzkomórkową nukleazą Staphylococcus aureus, hydrolizująca wiązanie 3' -5' fosfodiestrowe jednoniciowego, lub dwuniciowego Dna do poli, oligo i mononukleotydów z resztą fosfonową na końcu 3' i wolną gr. Fosforanową na końcu 5'. Aktywność enzymu uwarunkowana jest obecnością, jonów Ca. W chromatynie szczególnie podatny na atak nukleazy mikropokalnej (hydrolityczny) jest DNA łącznikowy (międzynukleosomowy).

Topografia enzymów Komorek

Enzymy znajdują się we wszystkich żywych komórkach. Ich rozmieszczenie zależy od rodzaju komórek a zwłaszcza od pełnionych przez nie funkcji. Enzymy występują w różnych częściach komórki. Często są określone w miejscach tworząc układy enzymatyczne.

Enzymy jądra komórkowego

Jądro komórkowe spełnia zasadniczą rolę w genetycznej kontroli syntezy białek enzymatycznych. Zawiera zatem enzymy związane z syntezą DNA oraz RNA, przede wszystkim odpowiednie polimerazy oraz nukleotydylotransferazy. W jądrze komórkowym występują także enzymy uczestniczące w przemianach nukleotydów między innymi syntetyzujących NAD, a także niektóre enzymy cyklu Krebsa, procesu glikolizy oraz cyklu pentozofosforanowego.

Enzymy mitochondrialne

Są związane z przemianami energetycznymi: cyklem Krebsa, procesem beta-oksydacji, utlenianiem komórkowym oraz fosforylacją oksydacyjną. Ponadto w mitochondriach występują liczne hydrolazy oraz kinazy.

Enzymy peroksysomów

Z frakcji mikroomowej oraz komórek kanalików nerkowych wyodrębniono peroksysomy zawierające enzymy z grupy oksydoreduktaz: katalazę, oksydazy aminokwasów, hydroksykwasów, a także oksydazę moczanową.

Enzymy Iizosomów

To hydrolazy, takie jak fosfataza kwaśna , rybonukleaza, beta- glukonidaza, katepryny oraz wiele innych enzymów o charakterze trawiennym. Oprócz enzymów hydrolitycznych w lizosomach wykryto również enzymy z grupy oksydoreduktaz

Enzymy struktur błoniastych

(błony komórkowej, błon cytoplazmatycznych gładkich i szorstkich, błon aparatu Golgiego, oraz błon jądrowych) z błonami tymi związane są fosfataza zasadowa glukozo-6-fosfataza, nukleozydo- di i tri- fosfatazy, 5'-nukleotydaza, pirofosfokinaza tiaminowa.

Enzymy rybosomów

Są one enzymami biorącymi udział w rybosomowej fazie syntezy białek. W rybosomach występują także białka różnych enzymów, które znajdują się w trakcie biosyntezy

Enzymy cytosolu

W tej frakcji komórkowej występują enzymy aktywujące aminokwasy. Enzymy syntezy kwasów nukleinowych, tłuszczowych, enzymy glikolizy oraz cyklu pentozofosforanowego.

---