Enzymy-białka katalizujące,możliw. katalit.>>od kat.chem;wysoka specyf. su bstratowa;zwiększ. V reakcji;działają w łagodnych war;można regulować ich aktywność;

E. regulatorowe-wrażliwe na sygn. metaboliczne (regulacja:allos-teryczna,białk. regulacyj.,przez fosforylację,aktywację proteolityczną);Koordy nują metabolizm;Biorą udział w chorobach dziedzicznych (nadmiar/brak akty-wności);

Klasy enz-1.oxydoreduktazy-r. oxydoredukcyjne;2.transferazy-przen oszą gr. chem;3.hydrolazy;4.liazy-rozkł. wiąz. CO,CN,CC i in. nie przez hyd-rolizę czy utlenianie;5.izomerazy;6.ligazy-łączenie 2 cząst. sprzężone z hydro lizą wiąz. w ATP lub innych triazo-P;

V reakcji chem-teoria zderzeń:temp. i stęż. S rośnie-wzrost V;Nie wszystkie zderzenia=reakcja (powody przestrzen-ne-brak kontaktu między gr. chem);brak E by pokonać barierę aktywacji;teor-ia stanu przejściowego Eyringa:każda reakcja ma niestab. formę ES,która ma więcej E swobodnej niż E+P;ΔG‡-E swobodna aktywacji Gibbsa:potrzebna do utw. ES.Najmniejsza il. E,którą trzeba dostarczyć 1 molowi S aby każda cz. os iągnęła ES;

Równ. Arrheniusa-k (stała szybkości)=p(czynnik przestrzenny) x z (częstość zderzeń) x e^ -ΔG‡/RT;Enzymy obniżają ΔG‡ reakcji w obu kier. o tę samą wartość;Nie zmienia się:ΔG^O,Kf/Kb (Kf-reakcja->,Kb <-),stała rów-nowagi K (Kf/Kb=[B]/[A]);

ΔΔG‡kat=ΔG‡niekat - ΔG‡kat.;Jeżeli ΔG‡niekat zmniejasza się o ΔΔG‡kat to V reakcji rośnie o e^ ΔΔG‡/RT (WWSR-ile ra-zy rośnie V);R= 0,008314,temp. w Kelvinach;WWSR jest b. czułą fkcją zmia-ny ΔG‡;

Centrum aktywne-wiąże S i ew. kofaktor,dostarcza reszt aminokw. bior. udział w katalizie (gr. katalityczne).S są tu wiązane i uzyskują korzystną orient. przestrzenną;Często są tu reszty polarne umiejsc. wewnątrz w środ. hy drofobowym;W tworzeniu ES biorą udział:wiąz. Van der Waalsa,elektrostat., wodorowe,hydrofob;

Msce substratowe-komplement. geometryczna-podobny kształt do S;elektornowa-reszty aminokw. są specyf. rozmieszczone,przycią-gają S;

Msce katalityczne-właściwa kataliza;

C. aktywne wg Koshlanda-K: aminokw. kontaktowe wiążą S i biorą udz. w katalizie;P:nie stykają się z S; S: stabilizują strukt. przestrzenną:

Modele oddziaływania E z S-klucza i zamka; ręki i rękawiczki (wymuszone/indukowane dopasowanie msca substr.);Budowa msca wiążącego S i jego zdolność dopasowania określają specyf. substr. E; Apoenzym (nieakt. białko enzymat)+Kofaktor=Holoenzym (aktywny);

Kofak-tor-słabo związ. z apoenzymem,mozna oddzielić przez dializę;jon metalu lub/i koenzym (zw.org.);Zapewnia właść. usytuowanie S i reakcje z nim (przenieś. e i H,gr. funkcyjnych);

Kosubstrat-kofaktor związany z apoenzymem na czas r. enzymatycznej;

Gr. prostetyczna-kafaktor silnie związ. z apoenz.;Po katali-zie kofaktor wraca do postaci wyjściowej;Jego związanie może wywołać zmia ny konformacji w apoenz;Specyf. substr. może zależeć od rodzaju kofaktora; Może on sprzęgać r. enzymatyczne;

Czynniki wpływające na aktywność E-pH,temp,potencjał red-ox,występowa nie kofaktorów,inhibitorów,aktywatorów,siła jonowa,stała dielektryczna;W war. optimum dla E wyznaczamy:aktywność (ilość J w roztw.),aktywność wła ściwą (ilość J w przeliczeniu na mg białka w preparacie),Km,kcat,ΔG‡;

pK gr. aminokwasowej typu kwas-zasada to -log ze stałej dysocjacji tej grupy albo takie pH środowiska,przy którym stęż. postaci kwasowej tej gr jest równe stęż postaci zasadowej: K=[H⁺][A^-]/[HA]; pK= -logK; pH= -log[H⁺]; pK+log[A^-]/ [HA]=pH; Jeśli [A^-]=[HA] to log [A^-]/[HA]=0 i wtedy

pK=pH;Wpływ pH na aktywność E-zależy on od:pK grup jonizujących w c.aktywnym i uczestniczą cych w wiąz. S;pK gr. funkc. w S którymi wiąże się on z E;pK gr. funkc. w E od których zależy akt katalizy;pK innych gr. w E których stan zjonizowania warunkuje katalitycznie aktywna konformację;pH środowiska wpływa na:wią-zanie S przez E;akt. katalit. E;stan jonizacji S;zmiany w struk. przestrzennej E Optimum w 1 kier.≠2 kier.;W danym pH kcat czyli Vmax/[Eo] bedzie propor cjonalna do części E w postaci E.Y^- jeśli ta postać jest wymagana do aktywno-ści (E.YH<->H⁺+E.Y^-);Vmax w danym pH=(Vmax)opt [E.Y^-]/[Eo];Jeśli [E.YH]=[E.Y^-] to [E.Y^-]/[Eo]=1/2 i Vmax w danym pH=1/2(Vmax)opt;

Gr. fu nkc. typu zasada-akt. katalit. zależy od występowania w E reszty YH w for-mie Y^-;Wraz ze wzrostem pH Vmax rośnie sigmoidalnie,bo E.YH zmienia się w E.Y^-;

Gr. funkc. typu kwas-akt. katalit. zależy od występowania w E reszty ZH w formie ZH;Wraz ze wzrostem pH Vmax maleje sigmoidalnie,bo E.ZH zmienia się w E.Z^-;Punkt przegięcia krzywych to pK^Y i pK^Z -wyznaczają one 1/2Vmax (jeśli różnią się o <niż 2 jednostki a (Vmax)opt nie została osiągnię-ta,to można je tylko oszacować);Znając pK można połączyć je z określ. reszta mi aminokw. w E (porównuje się z aminokw. w krótkich peptydach);Na pK ma wpływ:ład. sąsiadujących reszt;polarność otoczenia;

Wpływ pH na chymo-trypsynę-Km≈Ks;Kcat/Km zmienia się dzwonowo;Kcat rośnie hiperbolicznie a Km parabolicznie;

Wpływ temp.-powoduje zwiększ. energii kinet. S czo zwi ększa proporcje tych z dostateczną il. energii do przekroczenia ΔG‡ i w efekcie

wzrostu Vo;Rośnie też energia E co w końcu prowadzi do denaturacji,tak więc trzeba zachować równowagę;

Termostabilność-zakres temp. w której E zach-owuje pełną aktywność;Optimum temp. zależy od czasu przyjetego do oblicza nia V reakcji,więc nie może charakteryzować enzymu!

Współczynnik temp. Q₁₀-wskazuje ile razy zwiększy się Vo przy wzroście temp. o 10^O;Q₁₀=Vt+10/ Vt;zamiast Vo mogę wstawić proporcjonalne k=stała·e^-ΔG‡/RT;

Przyrost V reakcji w %-ΔV₁₀=(Q₁₀-1)·100;Q₁₀ dla r. enzymat.=1-2,dla nieenzymat.=2-3;

Wpływ potencjału red-ox na ureazę-aktywuje się w miarę obniżania poten-cjału (wzrasta stopień redukcji mostków S-S czyli odtwarzają się gr -SH isto tne dla jej aktywności);

Kinetyka-bad. szybkości reakcji z poznaniem jej mechanizmu;pozwala okreś-lić powinowactwo E do S i I i poznać jego wydajność;pozwala ustalić mech. katalit. i rolę enz. w kom.;Jeśli aA+bB->P to V=k [A]^a [B]^b (V jest proporc. do iloczynu stężeń reagentów podniesionych do potęgi równej liczbie cząst. tego reagenta);

Rząd reakcji-określa l. at. lub cząst.,których stęż. determinuje kine-tykę (tu:a+b);

Cząsteczkowość mówi ile cząst. bierze udział w najwolniejszym etapie reakcji;Rzędowość=cząsteczkowość,nie odwrotnie!;I-rzędowa:A->P (V prporc. do stęż. 1 substratu);V=k[A];k=s^-1;II-rzędowa:A+B->P (V proporc. do stęż. 2 substratów);V=k[A][B] lub 2A->P (V proporc. do ^2 stęż. 1 substratu); V=k[A]²;k=M^-1 s^-1;

t ½ S w reakcji I=ln2/k=0,693/k (niezależny od [Ao]);

t ½ S w reakcji II=1/k[Ao] (zależny od [Ao]);Szybkość początkowa

Vo jest nie-zależna od rzędu reakcji;Vo określamy w łatwym do zbadania momencie:zna-ne są ilości dodawanych S;nie ma P,więc nie występuje reakcja odwrotna ani inhibicja;

V= Vo tylko wtedy,gdy t reakcji jest odpowiednio krótki (zanim wię cej niż 10% S ulegnie zmianie w P);

Stała Michaelisa-Menten-w początkowej fazie reakcji ustala się stan równowagi miedzy ES a E i S (k+1,k-1).Szybkość rozkładu ES do E i P (k+2) jest zbyt mała,aby go zakłócić,czyli k-1>>k+2;Tak więc k+1[E][S]=k-1[ES], [E][S]/[ES] = k-1/k+1=Ks;Szybkość tworzenia P za leży od [ES];Vo=k+2[ES]<-ogólne równanie określ. szybkość reakcji enzymat; Vmax=k+2[Eo] przy wysycającym stęż. początk. [So]>>[Eo] to [S]≈ [So] i Vo=Vmax [So]/[So]+Ks;

Modyfikacja Haldane'a-założenie,że ustala się stan równowagi między k+1,k-1 i k+2.Wtedy k+1[E][S]=(k-1+k+2)[ES], [E][S]/ [ES]=k-1+k+2 /k+1=Km; Vo=k+2[ES]<-ogólne równanie określ. szybkość re akcji enzymat;Vmax=k+2[Eo] przy wysycającym stęż. początk. [So]>>[Eo] to [S]≈ [So] i Vo=Vmax [So]/[So]+Km;Dla Vo=½ Vmax Km=[So];

Równa-nie Lineweavera-Burka:1/Vo=1/Vmax+Km/Vmax x 1/S;Analizę kinet. roz-poczyna się od równania MM;Po kilku ms przechodzi się do BH;MM i BH są prawdziwe dla:1)reakcji z udziałem 1 S (pseudo-1-substr.,wielosubstr. ale ba-dane w odniesieniu do 1 S-pozostałe utrzymywane w stałym stęż.);2)enzymu z 1 mscem wiążącym S (może być więcej pod war. że nie współdziałają ze so bą);3)1 komplexu pośredniego ES (jeśli ES->EP jest etapem ogranicz. V rea-kcji);Km-może służyć do identyfikacji E (nie zależy od [E] i jest charakteryst. dla danego ukł. E i S);jest wskaźnikiem kierunku przemian S;pozwala ustalić wysycające E stęż. S;Jest miarą stabilności ES;Znając Km można obliczyć uła mek obsadzonych msc katalit. przy danym [S] (podst. do wzoru BH,im więk-sze Km,tym więcej obsadzonych msc);Km nie musi być miarą powinowactwa E do S.Jest nią Ks (niskie Ks-wysokie powin. i na odwrót);Km może być miarą powinowactwa tylko,gdy k-1>>k+2;

Wyznaczanie kierunku przemian za po mocą Km-większe Km,przez co większe nasycenie substratem preferuje 1 ze szlaków;Znaczenie ma tu też:[E],wartość Vmax przy danym [E],efekt działa-nia inhibit. i aktywat.,pH,temp;

Oznaczanie aktywności enzymat.-podczas jej oznaczania prowadzi się reakcje 0-rzedu (pełne nasycenie E przez S);Wtedy V reakcji=V max dla danego [E];Stężeniem wysycającym jest S=100 Km (wte-dy Vo=99% Vmax);Ustala się czas,w którym reakcja przebiega wg 0-rzędu;

Zależność między stałą równowagi a stałymi kinetycznymi-K=[P]/[S]= k+1 k+2/k-1 k-2= Vmax^S Km^P/ Vmax^P Km^S;Jeżeli znamy K (niezależne od obecności E),to dzięki temu równaniu można sprawdzić wiarygodność stałych reakcji enzymat.,które wyznaczyliśmy;

Stała katalityczna Kcat-maxymalna aktywność E niezależna od jego stęż.; miara wydajności E przy pełnym wysyceniu S;Kcat=Vmax/Eo = [1/s];Nazy-wana też liczbą obrotów (max liczba moli S,którą 1 mol E z 1 centrum aktyw-nym przekształca w ciągu jedn. czasu).Jest stałą reakcji I-rzędowej.Im wyższa tym lepiej!Stała specyficzności substratowej-Kcat/Km = k+2 k+1/k-1+k+2; [1/M·s];Doskonałość enzymów-Kcat/Km jest największe dla k+2>>k-1.Wtedy za k-1 przyjmujemy 0 i Kcat/Km=k+1;k+1 to stała szybkości reakcji II-rzęd., czyli tworzenia ES;k+1 nie może być >max częstotliwości zderzeń E z S wy-noszącej 10⁸-10⁹ 1/s·M, a więc Kcat/Km może być miarą katalit. doskonałości E (każde zetknięcie takiego E z S kończy się katalizą);Wydajność E w war. fizjolog.-tu [S]≤Km,więc [S]/Km=0,01~1,0; Vo=Kcat/Km ·[E][S];

Jednostka standardowa E [J]-taka ilość E,która kat. przemianę 1 μmola S w ciągu 1 min przy pełnym wysyceniu E [μmol/min]->aktywność całkowita;

Stężenie E w roztw-[J/cm³];Aktywność właściwa-stopień czystości prepara-tu;Liczba jedn. standardowych przypadająca na 1mg białka [μmol/min/mg bia łka];Aktywność molekularna-miara zdolności katalizowania reakcji;Liczba cz. S przekształconych w P w czasie 1 min przez 1 cz. enzymu [1/min=kcat = liczba obrotów na minutę jeżeli przeliczona na 1 c. aktywne];Katal-jednostka aktywności enzymat.,jest nią taka aktywność (ilość lub wielkość aktywności), która przekształca 1 mol S w czasie 1s [mol/s];1 kat=6*10⁷J;1 J= 16.67*10^-9 kat;Aktywność roztworu-stęż. aktywności enzymat. w roztworze [μkat/l]; Wydajność-akt.całk. końcowa/wyjściowa ·100%;Stopień oczyszczenia-akt. właść. prep. końcowego/wyjściowego;

Inhibicja-hamowanie aktywn przez małe,specyf. cząst,jony;Inhibicja odwra-calna-1)paraboliczna:związ. 1 cz. I w c. aktywnym E pozwala na reakcję dru-giej cz. I->2 cz. razem powoduja usunięcie S;2)hiperboliczna:I wiąże się z E w innym mscu niż S zmniejszając powinowactwo E do S ale nie wpływając na k+2;Zwiaz. S powoduje zablokowanie msca wiaz. I czyli nie może on przyłą-czyć się do ES;1)kompetencyjna-zmniejsza liczbę cz. E wiążących

S;I przyczepia się w msce S;Km'=Km(1+[Io]/Ki);Ki=[E][I]/[EI]=k-3/k+3 przekształcania EI w E i odwrotnie;Zmniejsza się Km,Vmax=const;2)akompe-tycyjna-I wiąże się tylko z ES;Wiąz. S-> zmiany konform. w E odsłaniające msce wiąz. I lub I wiąże się bezpośrednio z S w ES;I nie walczy o msce z S; Km'=Km/(1+[I]/Kj);Kj=[ES][I]/[ESI];Spada Km i Vmax (wykres równoleg-ły);3)niekompetencyjna-I wiąże się w mscu katalit. lub innym;Zmniejsza się liczba obrotów E;Km=const,Vmax spada;Może powstać ESI;Założenia:Km≈ Ks i S nie zakłóca wiąz. I i na odwrót (Ki=Kj);Przykład:obniżenie pH blokuje akceptor protonów w mscu katalit. chymotrypsyny;4)mieszana-I może wiązać się z E jak i ES;Spada Km i Vmax;5)allosteryczna-I wiąże się z mscem innym niż wiążącym S;I tworzy komplexy podleg. przemianom,wpływa na zmiany konform. zmieniające zdolność E do wiąz. S lub przebieg reakcji;Wykres MM jest sigmoidą (Vo niższe przy małym So,przy wyższych większe);6)częściowa ESI->E+P+I;Wykresy pochodne tgα lub 1/Vmax są nieliniowe-można odróżnić od inhibicji,w której tworzą się komlexy nie podlegające przemianom do P;7) substratem-1 cz. S wiąze się z 1 mscem wiążącym E;2-ga cz. S wiąże się z 2-gim;Powstaje ES nie podlegający dalszym przemianom;Inhibicja nieodwra-calna:I tworzy wiąz. kowalenc z gr. fkcyjną E (cyjanki-Zn,Fe,Cu;PHMB-SH; Jodooctan-SH;DJPF-Ser-OH);Gdy I>>E V'max=Vmax·Eo·(1-[Io]/[Eo]);Przy krótkim pomiarze można otrzymać obraz dla inhib. niekompetencyjnej (Km= const a Vmax spada);Odróżnianie odwracalnej od nie-dializa;stopień inhibic ji w zależności od t inkubacji z I;szybkość osiągania rónowagi w reakcji E+I; możliwość całkowitego zahamowania reakcji w war. nadmairu I;

Reakcje z wieloma S-przykład:reakcje kat. przez dehydrogenazy lub transfera zy;Cleland-E+A+B<->kompl. przejściowe->E+P+Q;2 typy kinetycznych me-chanizmów reakcji:1)sekwencyjne-wszystkie S muszą być związane z E przed uwolnieniem pierwszego P;Wykresy 1/Vo od 1/[A] lub [B] przecinają się z le-wej strony osi 1/Vo;Mogą być:a)uporzadkowane-dołączanie S i odłączanie P w określ. kolejności;b)losowe-brak kolejności;2)ping-pong-1 lub więcej P uw-alnia się przed przyłączeniem wszystkich S do E;Rozpoznanie mech. reakcji -dane experyment. przedstawiamy na wykresie za pomocą równania:1/Vo= Km^A/V₁·1/[A]+1/V₁91+Km^B/[B]);Jeżeli jest mech. jest typu ping-p bi-bi,to ot-rzymujemy szereg linii równoległych na podst. których wyznaczamy stałe kin etycz.;Jesli dane nie pasuja do tego wzoru to opieramy się na równaniu:1/Vo= Km^A/V₁·(1+Ki^AKm^B/Km^A[B])·1/[A]+1/V₁·(1+Km^B/[B]).Przyjmujemy za sta-łe [A] a następnie [B].W obu wypadkach,jeśli mechanizm jest uporządkowa-ny sekwencyjny otrzymamy szereg linii prostych przecinaj.się w 1 pkcie;Ro-zpoznanie mech. przez hamowanie produktami-rozpatrujemy reakcje typu Bi-Bi (2 S i 2P);1)sekwencyjny uporządkowany:jabłczan (B)+NAD(A)-E-> szczawiooctan (P)+NADH­­­(Q)+H;B wiąże się z EA nie z E;Q jest mieszanym I wobec B przy stałym A i kompetencyjnym wobec A przy stałym B;P-miesza nym w obydwu przypadkach;2)Ping-pong bi-bi z 1 mscem wiązania S-Asp(A) +2-oxoglutaran(B)-E->szczawiooctan(P)+glutaminian(Q);szczawiooctan jest I mieszanym dla Asp a kompetencyjnym dla 2-oxoglut.;Glutaminian-odwrotnie; 3)sekwencyjny losowy-A+B+E<->EAB<->EPQ<->E+P+Q;2 P i 2 S mogą wi ązać się bezposrednio z E,tak więc P i Q współzawodniczą z A o E gdy [B]= const orazz B o E gdy [A]=const. (inhib. kompetencyjna);Rozpoznanie mech. metodą wymiany izotopów w stanie równowagi-1)ping-p:sacharoza P-X(A) +fosfor(B)<-E->fruktoza(P)+glukozo-1-P(Q).wymiana izotopów:fruktoza(P*) +fruktoza-glukoza P-X(A)<-E->glukoza-fruktoza* P*-X(A*)+fruktoza(P);fos for³² (B*)+glukozo-1-P B-X(Q)<-E->glukozo-1-P³² B*-X(Q*)+fosfor(B);Pro-dukt P to część A;Q składa się z pozostałej w c. aktywnym części A oraz z B; E=fosforylaza sacharozy;2)sekwencyjny:glukozo-glukoza P-X(A)+fosfor(B) ->glukozo-1-P B-X(Q)+glukoza(P);W obecności E nie ma wymiany izotopów: maltoza(A) i C¹⁴glukoza(P),glukozo-1-P(Q) i P³²(B);A i B są jednocześnie w c. aktywnym;

Hipoteza Fishera-klucz-zamek;

Hipoteza Ogstona-S przył. się do pow. E w min. 3 mscach,reakcja zachodzi w 1 z tych miejsc.

Koshland-reka-rękawiczka indukowane dopasowanie E.Aktywator stabilizuje właściwą konform. a I unie możliwia jej przyjęcie.Gr. katalit. nie występują w optymalnym ułożeniu,S wy musza to ułożenie,następuje też odkształcenie S;E w tej konform. jest niestabi lny,niewłaściwy S ma małe szanse wymuszenia aktywnej konformacji.

Specy-ficzność:substratowa-decyduje o niej bud. msca wiążącego S i jego zdolność dopasowania się;1)absolutna-ureaza,oksydaza glukozowa;2)grupowa-atakowa na jest 1 gr. fkcyjna w grupie pokrewnych związków (lipaza,hexokinaza);

Ste-reospecyficznośc-wzgl. 1 izomeru optycnego (odróżnia enzymy od kat. chem icznych);

wzgl. dług. łańcucha węglowego w S-zmiana il. gr. CH₂ jest inhibito rem (zmienia się wzajemne poł. msc katalitycznego i substratowego oraz zdol ność dopasowania się (oxydaza L-aminokwasowa);

wzgl. innych gr fkcyjnych w S niż te ulegające przemianie (chymotrypsyna);

Rodzaje katalizy-

1) ogólna a)kwasowa:częściowe przeniesienie H+ z kw. Brönsteda,obniżenie ΔG ES;b) zasadowa:częściowe przeniesienie H+ z kw. Brönsteda,efekt j.w;czasem za-chodzą obie naraz;c)Specyficzna kw.-zasadowa:V proporc. do [H⁺] i [OH^-] a więc wymaga dużych ich stężeń trudnych w org;W tautomeryzacji (postać ketonowa~enolowa) i mutarotacji (zamiana OH z H w anomerach glukozy) połączone katalizy ogólne kwasowa i zasad.;V mutarotacji glukozy rośnie z pojawieniem się ogólnych kwasów i zasad;maja tu znaczenie His,Asp,Glu, Cys,Try,Lys;

2)kowalencyjna-przyspieszenie przez przejściowe wiąz. kowale- ncyjne miedzy S a kat. (dekarboxylacja acetooctanu-nukleofilowa reakcja S-katalizator;wychwycenie e przez elektrofilowy kat.;odłączenie kat;);Gr. z mo-bilnymi e:His,Cys,Ser,Asp,Lys;Im bardziej zasadowa uczestnicząca gr.,tym większa V reakcji;Udział biorą też koenzymy z centrami nukleofilowymi(TPP, PLP);

3)z jonami metalu-a)metaloenzymy-jony silnie związane (Fe,Cu,Zn);b) E aktywowane Me-luźno wiążą Me z roztw.(Na,K,Mg);Me wiążą S i odpowie dnio ustawiają,elektrostatycznie stabilizują/chronią ładunek `-` na S (odpycha-ją pary e atakujących je nukleofili,zwłaszcza anionowych);pośredniczą w oks-ydo-red. zmianie stanu utlenienia;

4)przez zbliżenie i ukierunkowanie-odpo-wiednie ułoż. reagentów wzgl. siebie indukowane przez E,ukierunkowanie,by orbitale odpowiednio zachodziły na siebie (sterowanie orbitalami);energia do takiego wiązania pochodzi z energii specyficznego wiązania S przez E;V reak cji zwiększa się przez ograniczenie względnych ruchów reagentów;E dopro-wadzając do zbliżenia cz. S zmniejsza odległość między nimi oraz zatrzymuje ich ruchy postępowe i obrotowe (zmniejsza entropię),przez co zwiększa się re aktywność

!5)elektrostatyczna-wiąz. S usuwa H₂O z c.aktywnego;maleje stała dielektryczna->silniejsze działanie naładowanych grup;zmiana pK reszt ami-nokw.;rozkład ład. w c. aktywnym stabilizuje stan przejściowy,może też kiero wać polarne S do msc wiążących i wtedy każde spotkanie dużego E z małym S kończy kataliza;

6)przez uprzywilejowane wiązanie stanu przejściowego-E napręża S do geometrii stanu przejściowego-używa do tego msc wiążących do których S nie pasuje;im mocniej E wiążę stan przejściowy względem siły wiąz. S,tym szybciej zachodzi reakcja;E często wiąże stan przejściowy dodatkowy-mi wiąz;S w takim stanie ma większe powinowactwo do E,stan przejściowy jest bardziej stabilny;E wiążą z taka samą siłą złe S (z małą V) jak dobre z wy soką;Energia wiąz. dobrych używana jest do stabilizacji stanu przejść (tak więc dobry S powinien mieć wysokie powinow. do E po aktywacji do stanu przejść

; Karboksypeptydaza A-Tyr 248:wypycha nadmiar wody z c. aktywnego zbli żając się do niego;Arg 145:wiąz. jonowe z COO- na C-końcu S;1)aktywacja wody przez Zn²⁺;2)przyjmowanie i oddawanie H⁺ przez Glu270;3).elektrostat. stabilizacja stanu przejść. przez Arg127 i Zn;

Chymotrypsyna-katalit. triada- Asp 102,His 57,Ser 195.*Ustawienie wiąz. peptyd a właściwie C karbonylowego do nukleofilowego ataku dokonywanego przez Ser 195 (kat przez zbliżenie i ukierunkowanie);*Polaryzujące działanie COO-Asp 102 na His 57 (kat elektro-statyczna);*Przyjmowanie H+ z OH Ser 195 przez imidazol His 57 (ogólna zasadowa);*Atak nukleofilowy CH₂O- Ser 195 na C wiąz. peptydowego (kat kowalencyjna);*Utworzenie tetraedrycznego stanu przejściowego (kat przez uprzyw.);*Rozkład stanu przejść do acyloenzymu-przeniesienie H+ z His 57 na NH pierwszego P peptydowego opuszczającego c. aktywne (kat kwasowa); *Przejęcie H+ z wody przez His 57 (kat zasadowa);*Atak nukleofilowy OH- z wody na C acylowy.Utworzenie tetraedrycznego stanu przejść (kat przez uprzyw.);*Rozkład stanu przej. i uwolnienie 2-go produktu peptydowego-prze niesienie H+ z His 57 na Ser 195 (kat kwasowa); Konformacyjne rozciąganie S które zachodzi podczas tworzenia tetraedrycznego stanu przejść. sprawia,że O karbonylowy hydrolizowanego wiąz. peptyd. zajmuje `dziurę oxonianu';Tam tworzy 2 wiąz wodorowe,które nie mogą byc utw. kiedy grupa C=C wystepuje w swojej normalnej trygonalnej konform;Rozciąganie pozwala też na tworze-nie nowego wiąz. wodorowego miedzy gr NH wiąz. poprzedzającego wiąz. hy drolizowane a enzymem;E wiąże tetraedryczny stan przejść. w sposób uprzy- wilejowany w stos. do komplexu Michaelisa (ES) jak i formy acylowanej E;

Analogi stanu przejściowego- umożliwiają wgląd w mechanizmy katalizy; silne i wysoce specyf. inhibitory kompetencyjne E (leki);jako antygeny służą do wytw. nowych katalizatorów;jako inhibitory niepożądanych,zanieczyszcza jących preparaty peptydaz;jako antybiotyk-w penicylinie jest pierścień β-lak-tamowy o podobnej strukt. do stanu przejść.(hamuje biosynt. ściany);PALA-inhib. karbamoilotransferazy asparaginianowej;

Określanie liczby podjednostek-1)dysocjacja:

a)środki denatutujace-mocznik +alkohole (mocznik odsłania obszary hydrofobowe dla alkoholi przez rozluź-nienie wiąz. wodor.),chlorowodorek guanidyny,sól sodowa siarczanu dodecy-lu (SDS),sole w wyższych stęż. (tworzą wiąz. wodor. niszcząc strukturę wody, zmniejsza się efekt hydrofobowy->białka rozwijają się i dysocjują);

b)zwiększ enie ład elektrostatycznego (odpychania miedzy podjednostkami oligomeru) poprzez zmianę pH,sukcynylację (bezwodnik kw. bursztynowego),maleilację (bezwodnik kw. maleinowego);

c)wiązanie metabolitu lub jonów-np. tatramer dehydrogenaza ald 3-P-glicer+ATP lub cAMP->dysocjacja;oktamer dehydr. glutaminianowa+GTP->dysocj;

d)reakcja z gr. -SH-jodooctan ICH₂-COO^-+ HS-białko->^-OOC-CH₂-S-białko;

Budowa podjednostek-bada się je przez: elektroforezę w żelu poliakryl. z SDS;analizuje wyniki oznaczeń aminokw. C i N końcowych;trawi się enzymami proteolitycznymi poszczególne protomery bada się istnienie izoenzymów oligomerycznych->wskazują na występowanie niejednakowych podjedn.;

Podjedn. identyczne-współdziałają w czasie kat. (zmiana konf. po przył. S w jednej indukuje zmiany w następnych)

;Podjedn. różne (katalityczne i regulatorowe)-podj. regul.+efektor allosteryczny->zmia-na konform. podj. katalit.;Stopień asocjacji E wielofunkcyjnych może decy-dować o fkcji katalit. (dedydr. ald-3-P w zależności od połącz. podjednostek może być dehydrogenazą lub esterazą);

Badanie która z form molek. jest ak-tywna-sączenie molek. E w różnych stęż.;aktywne ultrawirowanie E w obecn S+odczynników reagujących z P w celu utworzenia związku pochłaniającego promieniowanie elektromagn (szybkość sedymentacji na podst. pojawiającego się P);hexokinaza (wirowanie w gradiencie)-glukoza+ATP->glukozo-6-P+ADP; glukozo-6-P:dimer-inhibicja; ATP i P:monomer-aktywcja;ferroxydaza-kilka łańcuchów;w świerzej surowicy+inhib. peptydaz-1 łańcuch;SDS,2-merkapte-nol-3 łańcuchy;Asparaginaza-przeważają tertramery,wyższe formy po liofili-zacji lub krystalizacji;po wymuszonej dysocjacji (mocznik)-asocjacja;

2)hybrydyzacja + elektroforeza-opiera się na zastosowaniu białek ze zmienio num ład w celu ustalenia liczby podjed.,jak mocno są zasocjowane;białko naty wne w równowadze z protomerami+zmodyfikowane w równowadze z protom. ->hybrydy będą różnić się ład. między sobą oraz od wyjściowych;hybrydyzuje się też izoenzymy (podobne funkcjonalnie enzymy,ale kodowane przez różne geny i różniące się ruchliwością elektroforetyczną);Często używa się war. de-naturujacych do dysocjacji białek oznaczonych i nie.Potem usuwa się te waru-nki (np. mocznik-dializą),następuje renaturacja i rekombinacja.Teraz elektro-foreza;

Odczynniki dwufunkcyjne-umożliwiają krzyżowe łączenie podjedn. i stabilizację oligomerów;sprzyjają one powst. wiązań wewnątrz cząst. poprzez: odpowiednio niskie stęż. białka;wysoki ład. cząst.;wysoki iloraz msca wiążące /odczynnik;odpow. długość ramienia odczynnika;w elektroforezie powstanie tyle dominujących frakcji,ile podjednostek;Wyniki badań z odczynnik. 2-fun-kcyjnymi mogą wskazywać na odl. miedzy podjedn.;W większości białek oli-gomerycznych podjedn. rozmieszczone są symetrycznie w mscach równoważ nych geometrycznie;Dn->2Cn->2n:D4->2C₄ (2 oligomery z symetrią C4)-> 8 (liczba protomerów);Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)-hybrydyzacja:zamra żanie i rozmrażanie podj. H i M daje 5 izoenzymów (H₄,H₃M...) o różnej ruch liwości elektroforetycznej;Karbamoilotransferaza asparaginianowa:zawiera ła-ńcuchy katalityczne (c) i regulatorowe (r);Wstępne bad. rentgenograf.=D3 (c6 r6);c6r6-parahydroxybenzoesan->2c3+3r2;Trimery katalityczne wyizolowano i poddano sukcynylacji (nie uległy dysocjacji),dimery też nie;hybrydyzacja z c3^S:c3^S+c3+r2->elektroforeza->c6r6,c3c3^Sr6,c6^Sr6;łańcuchy c nie wymieniały się miedzy trimerami;także dimery zachowały integralność;Wynik:(c3)₂(r2)₃;

Regulacja aktywn. E-1)allosteria:oddziaływanie kooperatywne między:msca mi wiążącymi efektor/substrat lub miedzy jednymi a 2;

Cechy E alloster.-zbu-dow. z podjedn.;nie obowiązuje ich kinetyka MM;bywają labilne w niskich temp.;poza c. aktywnym wystepuje c. allosteryczne;mogą być wrażliwe na dzi ałanie 1 lub kilku efektorów;

Uniewrażliwienie E na efektory-delikatne ogrze wanie i działanie mocznikiem (dysocjacja na podjedn);stosowanie czynników modyfik. c. allosteryczne

;Kinetyka-Km i Vmax nie mogą być stos. do wyzn. Vo przy danym [S] (krzywa sigmoidalna);tylko dla stężeń S dużo niższych od nasycającego można wnioskować (na podst. wykresu zależn. Vo od [S]) o wła ściw. regulacyjnych E;Allosteria może być:*pozytywna:#homotropowa-wystę puje to M-monomer i S-ligand;M₂+S-wolno>M₂S+S-szybko>M₂S₂;Y=[M₂S₂] /[(M₂)o]->obsadzenie msc wiążących;Kb=[M₂S₂]/[M₂][S]²->stała wiązania li-gandu;logKb+nlog[S]=log(Y/1-Y)->równanie Hilla:n-ilość ident. msc wiążą-cych;Y<0,1-mało ligandu by zapełnić >1 msce wiążące;Y>0,9-mało cząst.,któ rych >niż 1 msce wiążące zostało nie zapełnione;W tych 2 przypadkach na-chylenie wykresu h=1 i nie ma kooperatywności;Jeżeli za to h>1-kooper. pozy tywna,h<1-negatywna;przy całkowitej kooperat. h=n,przy częściowej h<n; Ligand to S,stan równowagi MM jest spełniony.Wtedy Vo≈[MS],Vo/Vmax= [MS]/[Mo]=Y;[MS]-liczba podjednostek związ. z S/jedn. obj;[Mo]-liczba wsz ystkich podjedn/jedn. objęt.;Trudno tu wyznaczyć Vmax,bo wykres LB nie jest liniowy;#heterotropowa (aktywacja);*negatywna-homo i heterotropowa (inhi-bicja)

;Model sekwencyjny-KNF,powinowactwo białka do ligandu zmienia się z liczbą związ. cz. ligandu;Każda podjedn. wiążąc ligand zmienia swoją ko nformację przez co indukuje podobną zmianę w sąsiedniej podjednostce;przy-łączanie się ligandu do tylko 1 msca wiążącego może wywołać dowolny efekt w innym mscu (włączając inhibicję);

W modelu jednoprzejściowym (MWC) cała cz. występuje w 2 odmianach (T i R) czyli o małym i dużym powinowac-twie do ligandu.Pozostają one w równowadze.Wiązanie ligandu sprzyja posta-ci R;powinowactwo zależy tylko od stanu strukt. IV-rzędowej;Nie ma on zas-tosowania do kooperatywności negatywnej-ułatwione wiąz. ligandu z postacią R może przesuwać równowagę tylko w kier. R w miarę jak [ligandu] rośnie; Wiąz. karbamoilofosforanu i Asp jest kooperatywne:6 łańcuchów katalit. i 6 regulatorowych (3 c. aktywne,2 alloster);E jest zdysocjowany,aktywny ale od-wrazliwiony.Aby zaszła aktywacja/inhibicja muszą być zasocjowane;R-CTP> T;T-ATP>R;CTP i ATP konkurują o c. allosteryczne;S+2C3->2C3 T->R akty wacja;6CTP+3r2-zmiany konf przenoszone na 2C3>R->T inhibicja;6ATP+ 3r2-//->T->R aktywacja;

Izoenzymy-kilka form 1 E w org. lub kom. kodowane przez różne geny;Mają różny skład aminokwas.,różny pI,można je rozdzielić elektroforetycznie;

LDH ma 5 różnych kombinacji 2 łańcuchów polipept. (H₄,H₃M...);podjedn. asocjują przypadkowo,więc skład izoenzymowy LDH w poszczeg. tkankach określa ak tywność 2 genów kod. te podjedn.;LDH charakteryzuje się:ruchliwością elektr oforet,termostabilnością,Km,Vmax,podatnością na działanie inhibit.aktywat, specyficznością substratową;Na podstawie składu podj. LDH można wniosko wać o chorobach;W sercu przeważa H₄ (dużo O₂);mleczan przechodzi w piro-gronian,niskie k-1 (pirogronian to inhib. alloster);Duże stęż. mleczanu powst. w innych tkankach wymusza kier. reakcji w stronę powstawania pirogronianu i znosi hamujące działanie tego zw. na H₄;W mięśniach przeważa M₄ (mało O₂);pirogronian->mleczan (brak hamowania przez pirogronian);mleczan->do krwi,pirogr. regenerowany w wątrobie

;Regulacja aktywności kinazy piro-gronianowej-ma podjedn.L₄ w wątrobie,M₄ w mięśniach i mózgu;L i M akty wują fosfoenolopirogronian (kooperacja) i fruktozo-1,6-BP;inaktywują ATP i Ala (allosterycznie);L regulowana przez odwracalną fosforylację;Niski po-ziom glukozy we krwi->glukagon->cAMP->PKA->kinaza kinazy-P->kinaza pirogronianowa-P (L) mniej aktywna-zapobiega zużywaniu glukozy przez wą-trobę gdy potrzebna w mięśniach i mózgu;Glukoza uwalnia się z glikogenu i nie jest rozkładana w wątrobie;

Hexokinaza-w mięśniach niskie Km->glukoza ->glukozo-6-P;Glu-6-P jest inhibit. allosterycznym;W wątrobie-glukokinaza- D-glukoza jest S;nie jest hamowana przez glu-6-P;wyższe Km wobec D-gluko zy niż hexokinaza;Insulina stymuluje jej biosyntezę;zwieksza stęż. cukru po posiłku;

Badania nad izoenzymami-inf. o metabolizmie w tk i organach;o róż nej lokalizacji i roli metabol. w obrębie 1 kom.;o różnicowaniu się i rozwoju tkanek;precyzyjnym regulowaniu przemian metabol;wystepowaniu czynni-ków środowiskowych zmuszających roślinę do adaptacji;stanie zdrowia orga-nizmu

Chromatografia-sączenie molekularne:Vcałk.=Vo(obj. zerowa,obj. rozpu-szcz. nie związ. z żelem,obk.fazy ruchomej)+Vi(obj. wewnętrzna,wewn. gr anulek,obj. fazy stacjonarnej)+Vp(obj. polimeru);Współczynnik podziału (część fazy stacjonarnej dostępnej do dyfuzji danej cząst.)

Kd=Ve(obj. elu-cyjna)-Vo/ Vi;Jeśli Kd=0,to Ve=Vo (cząst. nie wnikają do granulek);0<Kd
1 (cząst. wnikające selektywnie);Vi
Vi+ Vp;Współczynnik dostęp-ności (część stacjonarnej obj. żelu dostępnej do dyfuzji danej cząst.);

Kav = Ve-Vo/ Vi +Vp; Vi+Vp=Vt-Vo; Kav=Ve-Vo/ Vt-Vo;dla danego żelu Kav/ Kd=const.;Kav=0->Vo=Ve (cząst. nie wnikają do granulek);0< Kav
1 (cząst. wnikające selektywni);Kav=1->Ve=Vt (cząst. swobodnie dyfunduj) Kav>1->Ve>Vt (cząst. oddziałują z nośnikiem);Zdolność rozdzielcza-zak-res mas cząst. cząsteczek wnikających do wnętrza granulek i selektywnie opóźnianych (różnią się wart. Kav);Sephadex-dextranowy,łańcuchy α-glu-kozy poł. mostkami z epichlorohydryny (tworzy pory);G-10-1g wchłania 1g H₂O,G200-1g wchł. 20g H₂O;Sepharose-agaropektyna (z ład.)+agaroza (bez ład.);Sepharose CL-otrzymana z Sepharose po reakcji z 2,3-dibromo-propanolem w środ zasad.;Ma większą stabilność term i chem;Żele poliak-rylamidowo-dextranowe-allilodextran+mostki z N,N'-metylenobisakrylami du;Pory o ścisłej wielkości (Sephacryl);HPLC-wysokociśnieniowa tkanka chromatograf.;Superdex-silnie usieciowana porowata agaroza (stabilność) z kowalencyjnie związanym dextranem (zakres frakcjonowania);Mała obj naniesionej próby daje ładny rozdział;Gęstość próby-im większa,tym gor-szy rozdział;Im dłuższa kolumna i wolniejszy przepływ,tym rozdział lep-szy

;Anionity-wymiana anionów z otoczeniem;białko wiąże się:pH buf> pI białka;nie wiąże się:pH buf<pI białka (np. DEAE,Q,QAE);Grupy wymie-niające jony związ. są z różnymi nośnikami (celuloza,agaroza..);

Kationity-wymiana kationów z otoczeniem;białko wiąże się:pH buf< pI białka;nie wiąże się:pH buf>pI białka (np.CM,S,SP);Eluowanie białek z jonowymie-niaczy:czynnikami konkurującymi z białkami o msce na wymieniaczu-elektrolity o różnym stęż.;przez zmianę ład. białek (pH środow.);Chromato graf. hydrofobowa-w temp. pokojowej;białka wiążą się z fazą stacjonarną hydrofobowo;Eluowanie:obniżenie siły jonowej,zmiana rodzaju jonów na jony o mniejszej zdolności wysalającej,obniżenie polarności środow.,zasto sow. detergentów;podziałowa-1)cieczowo-cieczowa:faza stacjonarn.-ciecz związana z nośnikiem oddziaływaniami fiz.;H₂O+ celuloza/skrobia/krzemi onka;wymywa się fazę stacjonarną;2)z fazą związaną kowalencyjnie;Nośnik-żel krzemionkowy;3)z fazą związaną normalną:faza stacjonarna (polarna)-żel krzem. +alkiloamina;faza ruchoma-zw. organ.(hexan);Wymywanie: zw.niepo-larne pierwsze;4)faza związana odwrócona:faza stacjonarna (nie-polarna)-żel krzem.+alkilosilan;faza ruchoma:alkohole,H₂O;Zalety:małe zmiany fazy ru-chomej,czuła na zmiany temp.;Wymywanie-zw. polarne pierwsze;Różnice między HIC (hydrofob.) a RPC (odwrócona)-faza stacjon. w RPC bardziej po-larna niż gr. czynne w HIC;gęstość występ. gr hydrofobowych w HIC < RPC; w HIC gr te oddziałują tylko z rejonami hydrofob. na pow. białek;w HIC wod-ne fazy ruchome mają dużą siłę jonową i pH 7, w RPC rozp. organ. i pH <7; powinowactwa-ligand:oczyszczone białko wiąże się z nim swoiście,łączy się z nierozp. nośnikiem wiąz. kowalenc.;Np.: analog substr.,efektor alloster.,koe-nzym,substrat,przeciwciało;Specyf. ligandu:absolutna i substratowa;Gr. funkc. ligandu muszą być dalej od nośnika-wbudowują odstępnik;powinow. do unie-ruchom. jonów metali-Cu,Ca;W białku (fibrynogen) wiążą się reszty His,Cys, Trp wiąz. koordynac z Me;Eluowanie-obniżenie pH,zastosow. EDTA;powi-now. do lektyn (białek o zdolności wiąz. węglowodanów);do oczyszcz. białko wych recept. błonowych,do rozdziału kom.;Eluowanie:bufor boranowy,zmiana pH,glikol etylen; immunopowinowactwa-ligand=przeciwciało;wiązanie-pH 7,średnie stęż. soli;Eluowanie-duże stęż soli+detergent,mocznik,SDS;z barwnikiem jako ligandem-oddziaływ. elektrostat.,hydrofob.;Eluowanie-w gradiencie soli, powinowactwo;kowalencyjna-ligand z gr. SH,Hg.Regeneracja kolumny z HgCl₂ w odpow. buforze;HPLC: >5MPa (<5 LPLC,=5 MPLC);Możliwość rozdziału przez kolumnę zależy od jej dł. i ilości teoret. stref wymiany na jedn. długości (wystarczająca przestrzeń aby rozdzielana subst. osiągnęła równowagę między fazą stacjon. a ruchomą);Im < cząst. fazy stacjon. zwi ązane z nośnikiem tym lepszy rozdział i >opór dla fazy ruchomej i trzeba by użyć dużego niszczącego fazę stacjon~nośnik ciśnienia;wprowadzono nowe fazy stacjon (drobniejsze i odporniejsze cząst.);HPLC-wysoka rozdz ileczość,szybkość rozdziału,czułość;możliwość automatyzacji;Nośnik+fa-za stacjonarna=złoże;

Wirowanie:różnicowe-kolejne wirowania,wzrastające g;o rozdziale decy-duje współcz. sedymentacji (na nią wpływają:kształt,wielkość,gęstość);Ws półcz. sedymentacji:S=V (szybkość sedymentacji)/ ω² (prędkość kątowa) r (odl. od osi obrotów);w gradiencie gęstości-1)zonalne:o rozdziale decydu-je wielkość,kształt,gęstość cząst. rozdzielnaych i lepkość,gęstość środowis ka;słaby rozdział mitochondriów,lizosomów,peroxysomów (podobna wielk ość);2)równej gęstości-a)osiąganie równowagi gęstości miedzy cząst. a śro dow. z zastosow. wcześniej wytw. gradientu gęstości (nie można białek ro zdzielić);b)... z gradientem tworzącym się podczas wirowania w CsCl,sach arozie (rozdział DNA,wirusów,rybosomów);Gradient po to,by po rozwiro-waniu homogenatu poszczególne frakcje były stabilizowane (zapobieganie wymienianiu);Rozdział oparty na różnicach rozp.-frakcjonowanie solami nieorg.(siarczan amonu),rozpuszczalnik. organ.(aceton,metanol),polimera-mi niejonowymi (glikol),denaturację term. (do wytracenia białek labilnych) obniżenie pH i siły jonowej,krystalizację;Wsalanie-sole oboj. zwiększają rozp. białek-zmienia się stopień jonizacji reszt aminokw. (zakłóca oddział. cząst. białka <-> cząst. białka, zwiększa cząst. białka <->rozpuszcz.;Wysa lanie-przy wysokim stęż. soli dużo oddziaływań jony <-> H₂O,mało oddzi aływań białka <->H₂O;Rozp. białka w pI jest najmniejsza;Frakcjon. rozp. organ. (aceton, etanol)-rozp. obniża stałą dielektryczną co zwiększa siły przyciągania grup o przeciwnym ład. z cząst białka i zmniejsza oddziaływ. cząst. białka <->H₂O;Rozpuszczalność białek przy określ. sile jonowej za leży od rodzaju jonów;polimerami niejonowymi-wypierają białka i inne makrocząsteczki

---