1 Co to jest miejsce aktywne?

Inaczej centrum aktywne, jest to specyficzny region cząsteczki białka enzymatycznego uczestniczący w wiązaniu substratu przetwarzaniu go w produkt. W jego strukturze można wyróżnić dwa elementy funkcjonalne: miejsce wiązania substratu i miejsce katalityczne.

2. 3 cele dla ktorych wyznaczamy Km (wykład 7)

• W celu wyznaczenia maksymalnej szybkości reakcji enzymatycznej.

• Porównania enzymów różnych tkanek, organizmów.

• Oceny panującego w komórce stężenia substratu.

• Pozwala na dopasowanie alternatywnego substratu do enzymu.

3. Co to jest stała substratowa?

Stała równowagi tworzenia i rozpadu kompleksu enzymatycznego- KS

Stała Michaelisa i stała substratowa

Stała Michaelisa jest wielkością wyznaczoną eksperymentalnie, zdefiniowaną ilościowo jako stężenie substratu przy, którym szybkość reakcji stanowi połowę szybkości maksymalnej. Do wyprowadzenia wzoru użyliśmy zależności Km=(k_-1 + k₊₂ )/ k₊₁

W niektórych reakcjach enzymatycznych k_-1 jest bardzo duże w porównaniu z k₊₂ .W takim wypadku k₊₂ można zaniedbać i równanie upraszcza się do Km ~ k_-1/k₊₁, Gdzie Km jest w przybliżeniu równe stałej dysocjacji kompleksu ES zwanej także stałą substratową Ks

Ks=[E] [S] / [ES] Często Km i Ks uważa się błędnie za synonimy , Nie można uważać Km za stałą dysocjacji kompleksu ES dopóki nie wiemy , że k₊₂ jest bardzo małe w porównaniu z k_-1

4. Co to jest stan przejściowy reakcji chem.?

Stan przejściowy - ściśle określona konfiguracja wiązań chemicznych wzdłuż jednej lub kilku współrzędnych reakcji. Konfiguracja ta jest zarazem punktem znajdującym się w globalnym maksimum hiperpowierzchni energii potencjalnej, co oznacza, że reprezentuje ona geometrię cząsteczki posiadającą najwyższą energią. Dla uproszczenia opisu zakłada się zazwyczaj, że stan przejściowy nie jest ulokowany na wielowymiarowej hiperpowierzchni, a jedynie na krzywej położonej na płaszczyźnie. Zaznaczany często symbolem ‡ (double dagger).

Zakładając, że analizowana reakcja jest nieodwracalna, oddziaływujące ze sobą cząsteczki po utworzeniu stanu przejściowego są zdeterminowane do uformowania produktów reakcji.

Przedstawiony na poniższym rysunku stan przejściowy występuje w przebiegu reakcji substytucji S_N2, w której bierze udział bromoetan i anion hydroksylowy

Mechanizm substytucji nukleofilowej dwucząsteczkowej z zaznaczonym stanem przejściowym

Powiedziała ciocia wikipedia

5. Co obrazuje wykres Arheniusa?

Jest to wykres będący linią prostą obrazujący energię aktywacji reakcji enzymatycznej.

Wykres ln k (stałej szybkosci reakcji) od odwrotnosci temperatury bezwzględnej, której współczynnik kierunkowy jest charakterystyczny dla danej reakcji.

6. Co hamuje reakcje enzymatyczna?

• Gwałtowne zamrożenie (suchy lód + etanol)

• Denaturacja (silny kwas, silna zasada, bufor do elektroforezy, wrząca łaźnia)

• Związek interferujący z danym enzymem(dla metaloproteaz czynnik chelatujący metale np. EDTA)

7. W jakim celu prowadzi sie dialize?

W celu oczyszczania białka. Dializa pozbawia białka substancji niskocząsteczkowych stosowanych na różnych etapach oczyszczania.

Stosowane są tu półprzepuszczalne pory maja pory wystarczająco duże, żeby mogły przez nie przechodzić małe cząsteczki. Białka i inne duże cząsteczki pozostają w worku dializacyjnym. Takie błony stosuje się zarówno przy oczyszczaniu, jak i przy zatężaniu białek.

8. Co to jest aktywnosc specyficzna i jak sie zmienia w miare oczyszczania? (wykład 8 )

W surowym ekstrakcie trudno mierzyć stężenie naszego białka enzymatycznego. Dlatego stężenie enzymu wyraża się w jed/ml. Stężenie enzymu w nieoczyszczonym preparacie podaje się jako specyficzną aktywność (jed/mg białka). Mierzy się ją przy nasycającym stężeniu substratu (v~V_max) i optymalnych warunkach pH i temperatury dla maksymalnej aktywności. Aktywność specyficzna białka enzymatycznego rośnie w miarę tego jak coraz większą masę białka enzymatyczngo stanowi nasz enzym, czyli w miarę jak postępuje oczyszczanie.

9. Co to jest kataliza kwasowo-zasadowa?

Prawie każda reakcja enzymatyczna zawiera pewien typ transferu protonów wymagający udziału gr. zasadowych i kwaśnych. W niektórych przypadkach protony i jony hydroksylowe działają bezpośrednio jako gr. kwasowe i zasadowe co nosi nazwę specyficznej katalizy kwasowo- zasadowej. Częściej jednak substraty organiczne, ko faktory lub boczne łańcuchy aminokwasów enzymu pełnią taką rolę działając jako kwasy i zasady Broensteda- Lowry' ego w uniwersalnej katalizie kwasowo - zasadowej.

10. Czemu inhibitor niekompetencyjny zmniejsza Vmax?

(Inhibitor tego typu wiąże się z enzymem w miejscu innym niż to wiążące substrat i hamuje reakcję przez jeden z wielu różnych mechanizmów.)

Inhibitor niewspółzawodniczy nie zmienia Km natomiast obniża V_max, ponieważ obniża on stężenie funkcjonalnego enzymu. Reszta enzymu zachowuje się jak bardziej rozcieńczony jego roztwór.

11. Co to znaczy ze inhibitor jest wolno wiazacy? Interesującą grupę stanowią inhibitory wolno wiążące się. W grupie tej znajdziemy

zarówno inhibitory odwracalne, jak i nieodwracalne. Zanik aktywności enzymu

przebiegający z udziałem tych pierwszych jest niezwykle powolny ze względu na czas

potrzebny na zmiany konformacyjne konieczne dla utworzenia kompleksu z enzymem.

Wolnowiążące się inhibitory nieodwracalne reagują z enzymem poprzez utworzenie

niekowalencyjnego stanu przejściowego, co prowadzi do utraty aktywności przez

enzym.

12. Co to jest IC50 i kiedy to wyznaczamy?

Stężenie inhibitora wymagane do osiągnięcia połowy całkowitej inhibicji to IC₅₀- Inhibitor Concentration giving 50% inhibition. Ten typ doświadczenia stosuje się do: badania wiązania ligandów do receptorów, śledzenia procesów komórkowych po związaniu ligandów, wpływu różnych czynników na proliferacje i wzrost komórek.

13. Na czym polega fluorescencja?

Padający foton wzbudza elektron w cząsteczce lub atomie. Wzbudzenie to wiąże się z przejściem elektronu do wzbudzonego stanu singletowego. Przy przejściu elektronu ze wzbudzonego stanu singletowego do stanu podstawowego następuje emisja światła. Długość fali promieniowania (wyemitowanego światła) jest dłuższa od długości fali zaabsorbowanej. Wynika to z degradacji części energii podczas przejść termicznych i bezpromienistych. Jest to tzw. przesunięcie Stokesa.

16. porównac inhibicje akompetycyjna i niekompetycyjna i narysowac wykresy te L- Burka,

Inhibicja niekompetycyjna, hamowanie niekompetycyjne (niewspółzawodnicze) - typ inhibicji odwracalnej enzymów.

Hamowanie niekompetycyjne zachodzi wtedy gdy inhibitor nie jest strukturalnie podobny do substratu i nie współzawodniczy z nim o centrum aktywne enzymu, jak w hamowaniu kompetycyjnym, lecz inhibitor blokuje częściowo centrum aktywne hamując przebieg reakcji enzymatycznej, pomimo tego substrat może być wiązany. Przykładem może być działanie siarkowodoru na enzymy zawierające w centrum aktywnym atom metalu, np. żelaza lub miedzi. Zjawisko to jest podstawą silnej toksyczności siarkowodoru.

Inhibitory niekompetycyjne nieodwracalne nie wykazują strukturalnego podobieństwa do substratu, zwiększenie stężenia substratu na ogół nie zmniejsza hamowania (np. gazy bojowe paraliżujące).

Inhibicja akompetycyjna[edytuj]

W inhibicji akompetycyjnej inhibitor nie może się wiązać do wolnego enzymu, a jedynie do kompleksu enzym-substrat (ES), tworząc kompleks enzym-inhibitor-substrat (EIS). Ponieważ w takiej sytuacji zmniejszone jest stężenie kompleksu ES, zwiększa to pozorne powinowactwo enzymu do substratu, zatem wartość Kmjest mniejsza. Utworzony kompleks EIS jest enzymatycznie nieaktywny i reakcja nie może być kontynuowana, dopóki miejsce aktywne enzymu nie zostanie zwolnione, co obniża Vmax w porównaniu do reakcji nieinhibowanej[74]. Ten typ inhibicji jest dość rzadki i może dotyczyć niektórych enzymów multimerycznych (wielopodjednostkowych).

tutaj radze siegnac do materialow z katedry biochemii pt inhibicja enzymatyczna :)

17. opisac cechy, właściwości enzymów oligomerycznych, które przedstawiają model jednostopniowy

Enzymy oligomeryczne zbudowane są z dwu lub więcej podjednostek połączonych niekowalencyjnie wiązaniami lub oddziaływaniami. Podjednostki te wiążą się ściśle określonymi zawsze tymi samymi obszarami kontaktowymi tworząc ściśle okteślony symetryczny układ przestrzenny.

Jego strukturę [IV-rzędową] określa ułożenie przestrzenne podjednostek [protomerów] oraz zespół ich kontaktów oraz oddziaływań wzajemnych.

Protomery mogą być zbudowane z jednego lub kilku łańcuchów polipeptydowych.

W łączeniu podjednostek i stabilizacji oligomerów oddziaływania hydrofobowe odgrywają większą rolę od wodorowych i jonowych.

Szczególną tendencję do asocjacji wykazują protomery zawierajace >30% aminokwasów hydrofobowych. Wynika to z faktu, że nie wszystkie reszty hydrofobowe mogą być upakowane wewnątrz cząsteczek, część z nich występuje na powierzchni.

Enzymy oligomeryczne mogą być zbudowane z:

- identycznych podjednostek współdziałąjących ze sobą w czasie katalizy. Zmiana konformacji jednej z podjednostek wywołana przyłączeniem pierwszej cząsteczki substatu indukuje zmianę konformacji pozostałych protomerów.

- z nieidentycznych podjednostek wśród których można wyróżnić katalityczne i regulatorowe.

Zmiana konformacji podjednostki regulatorowej wywołąna związaniem efektora allosterycznego powoduje zmiany strukturalne podjednostki zawierającej centrum aktywne.

Przykładem enzymu oligomerycznego jest karbamoilotransferaza asparaginianowa, katalizująca przeniesienie karbamoilofosforanu na kwas asparaginowy (powstaje kwas karbamoiloasparaginowy - prekursor CTP i UTP).

Enzym składa się z 6 podjednostek katalitycznych i 6 regulatorowych.

Część enzymów oligomerycznych to enzymy wielofunkcyjne. Pojawienie się określonych funkcji katalitycznych może zależeć od stopnia asocjacji podjednostek. Np. dehydrogenaza aldehydu 3P-glicerynowego jako tetramer wykazuje aktywność dehydrogenazy i niewielką aktywność esterazową, a jako dimer aktywność esterazową.

Heksokinaza katalizująca reakcję fosforylacji glukozy przez ATP (96000,4 łańcuchy) dimeryzuje w obecności Glu 6P i w tej postaci nie wykazuje aktywności.

18. co to jest triada katalityczna i jaki jest jej udział w katalizie

katalityczna triada to, nazywając inaczej, trzy reszty aminokwasowe które bezpośrednio lub pośrednio biorą udział w reakcji chemicznej z substratem - sa to niezbedne reszty aminokwasowe dla zajscia reakcji. znajduja sie w centrum katalitycznym enzymu. 

W przypadku chymotrypsyny sa to reszty Asp, His i Ser - tworza katalityczna triade. His i Ser bezposrednio reaguja z wiazaniem peptydowaym a reszta Asp stabilizuje dodatnio naladowana forme histydynę z triady. wszystkie trzy sa niezbedne do przeprowadzenia reakcji. pozostale aminokwasy w bialku nie uczestnicza w reakcji - mozesz sobie wyobrazic ze tworza "rusztowanie" na ktorym w bardzo specyficznych miejscach (!) umocowane sa reszty aminokwasowe triady katalitycznej. 

22. cos o heksokinazie, jej izoformach chyba i jakos powiazane to było z Km????????

Heksokinaza (EC 2.7.1.1) jest enzymem z klasy transferaz. Katalizuje pierwszą reakcję glikolizy, polegającą na fosforylacji glukozy doglukozo-6-fosforanu. Jest to reakcja fizjologicznie nieodwracalna. Jest enzymem mało swoistym, oprócz glukozy fosforyluje inne heksozy. Występuje w wielu formach izoenzymatycznych. Jedna z nich, nosząca nazwę glukokinaza, występuje w wątrobie i znacząco różni się od innych postaci tego enzymu; wykazuje ona 7-krotnie wyższą wartość Km.

Glukokinaza - enzym (EC 2.7.1.2) katalizujący reakcję fosforylowania glukozy do glukozo-6-fosforanu. Glukokinaza występuje w komórkach wątroby, trzustki, przewodu pokarmowego i mózgu u człowieka oraz większości kręgowców. W każdym z tych organów odgrywa ona istotną role w regulacji metabolizmu węglowodanów. W odpowiedzi na zmiany stężenia glukozy, glukokinaza decyduje o przebiegu metabolizmu komórki. Aby katalizować fosforylację glukozy wymagane jest jej odpowiednio wysokie stężenie, ponieważ Km glukokinazy jest około 100 razy wyższa niż w przypadku heksokinaz. Ufosforylowana glukoza, w przeciwieństwie do nieufosforylowanej, nie może swobodnie opuścić komórki.

Inhibitory aktywowane przez enzym, nazywane także samobójczymi lub „końmi

trojańskimi” - reagują one z proteazą dając produkt przejściowy ulegający następnie

kolejnej reakcji, która nie zachodzi w trakcie normalnie przebiegającego procesu katalitycznego

---