CHROMATOGRAFIA SITOWA (żelowa, sączenie molekularne) - podstawę podziału stanowią różnice w rozmiarach cząsteczek - rozdział zachodzi na skutek różnicy mas cząsteczkowych rozdzielanych związków.
    Chromatografia żelowa stosowana jest do rozdziału białek różniących się masą cząsteczkową lub do oddzielania białek od składników niskocząsteczkowych np. sole (odsalanie) lub związki używane do znakowania białek np. J125, fluoresceina.
   Kolumnę chromatograficzną wypełnia się złożem w postaci ziarenek o średnicy około 0,1 mm o zdefiniowanej wielkości porów zbudowanych z nierozpuszczalnego polimeru (typu: dekstran, agaroza) lub poliakrylamidu.

Sita molekularne

1. Sephadex - na bazie dekstranu

2. Sepharose - granulowana forma agaru

3. Sephacryl - całkowicie syntetyczne sito molekularne

Teoria filtracji żelowej

• cząsteczki o określonych rozmiarach dyfundują w głąb ziaren żelu tylko na określoną głębokość

• większe cząsteczki są eluowane wcześniej niż mniejsze

• faza nieruchoma = rozpuszczalnik zalegający wnętrze ziaren żelu

• faza ruchoma = rozpuszczalnik przemieszczający się pomiędzy ziarnami żelu

Po nałożeniu na żel mieszaniny, białka o małych rozmiarach wnikają do wnętrza ziaren duże natomiast nie mogą. Droga do momentu wycieku z kolumny, którą musi pokonać każdy ze składników próbki jest więc nierówna. Cząsteczki o najmniejszym ciężarze cząsteczkowym mają do pokonania najdłuższą drogę i dlatego wypływają najpóźniej z kolumny. Białka o dużej masie cząsteczkowej i o efektywnej średnicy większej niż pory ziaren złoża mają do pokonania krótszą drogę w żelu i wędrują najszybciej. Pojawiają się zatem jako pierwsze u wylotu kolumny.

Warunki rozdziału
   Do filtracji żelowej najczęściej stosuje się kolumny o długości 50-90 cm, wraz ze wzrostem długości kolumny zmniejsza się szybkość rozdziału białek.
Objętość nakładanej próby nie powinna przekraczać 5% całkowitej objętości kolumny.
Skład buforu elucyjnego nie wpływa bezpośrednio na rozdział białek, ale w celu zmniejszenia oddziaływań jonowych pomiędzy złożem a rozdzielanymi związkami nie stosuje się buforów o sile jonowej słabszej niż 0,02M.

Podstawy teoretyczne - parametry retencyjne

Całkowity czas retencji (t_R) = czas liczony od momentu wprowadzenia próbki do momentu pojawienia się na chromatogramie maksimum piku (momentu pojawienia się na wyjściu z kolumny maksymalnego stężenia wymywanego związku)

Całkowita objętość retencji (V_R) = objętość fazy ruchomej potrzebna do wymycia składnika, mierzona od momentu wprowadzenia próbki do momentu pojawienia się na chromatogramie maksimum piku:

V_R = F₀ ∙ t_R

F₀ - prędkość wypływu fazy ruchomej z kolumny (cm³/min)

Zerowy czas retencji (t_M) = czas przebywania w kolumnie substancji, która nie oddziałuje z fazą stacjonarną (np. He w chromatografii gazowej)

Zerowa objętość retencji (V_M):

V_M = F₀ ∙ t_M

Zredukowany czas retencji (t'_R) = różnica między całkowitym i zerowym czasem retencji

t'_R = t_R - t_M

Zredukowana objętość retencji (V'_R):

V'_R = V_R - V_M

Zredukowany czas retencji i zredukowana objętość retencji charakteryzują zatrzymywanie się próbki na fazie stacjonarnej i są wielkościami charakterystycznymi dla danej substancji.

Względny czas retencji:

r_i,w = t'_Ri / t'_Rw

„i” - dowolna substancja

„w” - substancja wzorcowa

Współczynnik retencji (k):

k = (t_R - t_M) / t_M

lub

liczba moli X w fazie stacjonarnej n_S c_SV_S

k = = =

liczba moli X w fazie ruchomej n_m c_mV_m

c_S, c_m - stężenie składnika X w fazie ruchomej i stacjonarnej

V_S, V_m - objętość fazy ruchomej i stacjonarnej

zawartość substancji w fazie nieruchomej

R_f =

zawartość substancji w fazie ruchomej

Równowaga podziału ma charakter dynamiczny - cząsteczki przemieszczają się pomiędzy fazami.

1

R_f =

1+k

R_f - współczynnik przepływu/współczynnik prędkości/współczynnik zatrzymania

Ułamek zawartości substancji w fazie nieruchomej wynosi:

k

= 1 - R_f

k + 1

W chromatografii planarnej stosuje się współczynnik R_M

1 - R_f

R_M = log = log k

R_f

Współczynnik selektywności a - wpływa na oddalanie pików

tR_B - t_M k_B

a = =

tR_A - t_M k_A

tR_A, tR_A - czasy retencji substancji A i B

k_A, k_B - współczynniki retencji substancji A i B

Sprawność kolumny

• zdolność kolumny do wytwarzania wąskich pików

• wyznacza się liczbą półek teoretycznych (N), która zależy od liczby równowag wzdłuż kolumny

Półka teoretyczna = objętość kolumny, w której zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniami substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i nieruchomej.

Kolumna chromatograficzna składa się z N półek toretycznych:

L = N ∙ H

L - długość kolumny; H- wysokość równoważna półce teoretycznej; N - liczba półek

Po wprowadzeniu substancji na „pierwszą półkę” kolumny ulega ona podziałowi między fazę ruchomą i stacjonarną, zgodnie z wartością współczynnika podziału K.

Zdolność rozdzielcza kolumny (R_S)

tR₂ - tR₁

R_S = 2 ∙

w₁ + w₂

tR2, tR1 - czasy retencji substancji 1,2

w_1,w₂ - szerokości pików mierzone przy podstawie

R_S - zależy od:

• selektywności wyrażanej współczynnikiem selektywności a

• sprawności kolumny - liczby półek teoretycznych N

• retencji wyrażonej ułamkiem zawartości substancji w fazie nieruchomej

---